產(chǎn)綠原酸金銀花內(nèi)生菌的分離研究論文(參考版)
2025-06-21 12:49本頁面
【正文】 也就能緩解當(dāng)前金銀花供不應(yīng)求的情況。基于目前金銀花的生產(chǎn)和需求現(xiàn)狀，利用其內(nèi)生真菌來生產(chǎn)其主要活性成分，為人類突破植物資源周期長、產(chǎn)量低、不可再生等限制。篩選出能使金銀花活性成分增加和抗病原菌的菌肥配方。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，分離得到的A324， B415，B431，這3株內(nèi)生真菌對(duì)金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌具有較強(qiáng)的抑菌活性，而對(duì)大腸桿菌則表現(xiàn)出較弱的抑菌活性。相應(yīng)的，也很可能會(huì)產(chǎn)生不同種類的代謝產(chǎn)物。綜合TLC與HPLC分析，推斷三株內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物中可能含有綠原酸類成分。 本實(shí)驗(yàn)采用了常規(guī)形態(tài)學(xué)與顯微鑒定相結(jié)合的方法對(duì)金銀花內(nèi)生真菌進(jìn)行了鑒定，確定了其歸屬，但還需要在后期的實(shí)驗(yàn)過程中利用測(cè)定內(nèi)生真菌DNA中ITS序列的方法進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證，為以后進(jìn)一步掌握和研究金銀花內(nèi)生真菌奠定基礎(chǔ)。 抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表13 內(nèi)生真菌抑菌圈直徑（cm）三組重復(fù)內(nèi)生菌指示菌金黃色葡萄球菌（cm）大腸桿菌(cm)綠膿桿菌(cm)A324＋＋＋＋＋B415＋＋－＋＋B431＋＋＋＋＋＋表示抑菌圈直徑≥10mm；＋表示抑菌圈直徑10mm；－ 表示無抑菌活性；實(shí)驗(yàn)設(shè)定三組重復(fù)，＋＋表示抑菌圈直徑≥10mm；＋表示抑菌圈直徑＜10mm；－表示無抑菌活性；根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，菌株對(duì)金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌具有較強(qiáng)的抑菌活性，而對(duì)大腸桿菌則表現(xiàn)出較弱的抑菌活性；菌株A32B415表現(xiàn)出的抑菌活性較強(qiáng)，菌株B431表現(xiàn)的抑菌活性較弱；分析原因可能是菌株B431發(fā)酵液中綠原酸含量較低造成抑菌圈直徑較小。初始培養(yǎng)基為馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基，自然pH值，同時(shí)在30℃的條件下培養(yǎng)菌株B415，；，正交試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基下菌絲最大生長量增大了4倍。表10 四因素三水平正交試驗(yàn)試驗(yàn)號(hào)ABCD菌絲干重綠原酸相對(duì)含量列號(hào)蔗糖蛋白胨pH值溫度mg/mLmg/ml111112122231333421235223162312731328321393321K1K2K3K1K2K3表11 發(fā)酵條件對(duì)菌絲干重影響的方差分析表因素偏差平方和自由度F比F臨界值顯著性葡萄糖2*蛋白胨2pH值2溫度2表12 發(fā)酵條件對(duì)綠原酸產(chǎn)量影響的方差分析表因素偏差平方和自由度F比F臨界值顯著性葡萄糖2*蛋白胨2pH值2*溫度2由表112可知，9個(gè)正交試驗(yàn)中，以A2B1C2D3為最佳組合，%,%，溫度30℃時(shí)，菌絲重量與綠原酸含量相對(duì)含量均達(dá)到了最大值。 溫度的選擇圖22 不同溫度對(duì)B415產(chǎn)生菌絲體重及綠原酸含量的影響由圖22可以看出，溫度過高或者過低，都不利于菌株在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長，所產(chǎn)生的菌絲體及綠原酸含量亦會(huì)降低，適當(dāng)?shù)臏囟葎t會(huì)增加細(xì)胞的生長速率，促進(jìn)菌株的次生代謝，綜上所述，本結(jié)果中顯示最適合菌絲體生長和綠原酸含量積累的溫度為28℃，故選擇28℃作為B415的發(fā)酵溫度。圖20 不同碳源對(duì)B415產(chǎn)生菌絲體重及綠原酸含量的影響通過圖20可以得知，不同碳源對(duì)菌株B415產(chǎn)生菌絲體重及綠原酸含量的影響不同，菌株在以蔗糖為碳源的發(fā)酵液中產(chǎn)生的菌絲體重及綠原酸含量最高，葡萄糖中最低，在淀粉及乳糖中產(chǎn)生菌絲體重及綠原酸含量的變化相近，因此選擇蔗糖為最佳碳源。 純化分離出的菌株發(fā)酵液形態(tài)圖17 菌株A324發(fā)酵液形態(tài)(菌球分散均勻，顏色黃色，大小適度)圖18 菌株B415發(fā)酵液形態(tài)（呈現(xiàn)出良好的發(fā)酵形態(tài)，孢子形成菌球后大小均勻，菌球四周稍帶菌毛）圖19 菌株B431發(fā)酵液形態(tài)（菌球白色，個(gè)體較大，分散較均勻）在菌株發(fā)酵實(shí)驗(yàn)過程中，應(yīng)在錐形瓶發(fā)酵液中加入幾小片碎玻璃，這樣在搖床不斷轉(zhuǎn)動(dòng)過程中會(huì)使孢子分散均勻，從而使發(fā)酵液菌球均勻。綠原酸產(chǎn)量在馬鈴薯培養(yǎng)基中產(chǎn)量最大，且在第5天后綠原酸含量降低，而在玉米粉中綠原酸最低。 液體基本培養(yǎng)基的選擇通過改變進(jìn)樣量體積，得到不同進(jìn)樣量X下的峰面積Y，進(jìn)而繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：圖14 B415在玉米粉葡萄糖培養(yǎng)基中的生長曲線及綠原酸含量圖15 B415在馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基中的生長曲線及綠原酸含量圖16 B415在豆芽汁葡萄糖培養(yǎng)基中的生長曲線及綠原酸含量比較菌株B415在不同培養(yǎng)基中的生長曲線及產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物含量，可知，在不同發(fā)酵液中B415的綠原酸產(chǎn)量和生長量都不相同。菌絲有分支，無隔 青霉屬花B431孢子單生，顏色淡綠色分生孢子梗細(xì)長，有分支菌絲體細(xì)長，有分支曲霉屬花表8 金銀花不同組織的內(nèi)生真菌種類及分布屬（Genus）根（Root）莖（Stem）葉（Leaf）花（Flos）總計(jì)（Total）毛霉屬（Mucor）01135青霉屬（Penicillium）983225鏈格孢屬（Alternaria）11013犁頭霉屬(Absidia)01001頭孢霉屬(Cephalosporieae)10203頭珠霉屬(Piptoaephalis)130
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