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干細胞研究方法及進展(參考版)

2025-05-15 18:33本頁面
  

【正文】 這為治療神經(jīng)退行性疾病提供了可能的方法。永生化神經(jīng)干細胞系可在體外長期大量增殖,同時可被轉(zhuǎn)染并在宿主體內(nèi)穩(wěn)定表達外源基因,將這些細胞植入損傷的神經(jīng)系統(tǒng)可作為基因治療的新策略。 Liang Peng等將人胚神經(jīng)干細胞移植到脊髓橫斷大鼠的病變區(qū)域, 3個月后,觀察到橫斷處神經(jīng)細胞軸突出現(xiàn)再生,運動功能部分恢復。神經(jīng)干細胞的發(fā)現(xiàn)為神經(jīng)損傷和腦退行性變的治療提供了可能的途徑。 BMP( 骨架多型性蛋白)促進神經(jīng)干細胞向星形膠質(zhì)細胞方向分化。 FGF2對神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞的祖細胞都有促分化作用,而 ECG僅對膠原祖細胞起作用。FGF- 2( 堿性成纖維細胞生長因子- 2)在胚胎早期維持神經(jīng)祖細胞的的生存,促進其增殖。 神經(jīng)干細胞的培養(yǎng) 從相應的部位取出組織后,用機械吹打的方法或是胰酶消化的方法使之成為單細胞懸液,在含有 EGF和 /或 bFGF的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng),一段時間以后,除干細胞外的其他細胞會逐漸死亡,而神經(jīng)干細胞則增殖形成克隆球。正常哺乳動物成年后,中樞神經(jīng)系統(tǒng)仍有神經(jīng)干細胞存在,只不過這些細胞平時處于靜止狀態(tài)。目前, Nestin已被用于神經(jīng)干細胞的鑒定。 目前得到普遍認可的神經(jīng)干細胞的概念是由Mckay在 1997年提出的:神經(jīng)干細胞是指具有分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞的能力,能自我更新并能提供大量腦組織細胞的細胞群。其后從成年鼠紋狀體、海馬齒狀回等處分離出能在體外不斷增殖,并具有向神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞分化潛能的細胞群。 神經(jīng)干細胞 關于神經(jīng)干細胞研究起步較晚,由于分離神經(jīng)干細胞所需的胎兒腦組織較難取材,加之胚胎細胞研究的爭議尚未平息,神經(jīng)干細胞的研究仍處于初級階段。 當然,該領域的研究尚處于探索階段,目前還存在很多問題有待解決: (1)對 MSC本身特性的研究,它的真正起源,實際利用希望得到純的干細胞成分,但實驗證明體外的 MSC均為各種細胞的混雜,如何能夠獲得純的 MSC, 尚需進一步研究; ( 2) MSC的增殖、分化的控制需要合適的條件,如何使既控制增殖,避免 發(fā)生腫瘤,又能在適當?shù)臅r候啟動所需要的途徑進行分化,有待于進一步探索; ( 3) MSC間相互作用, MSC與造血干細胞間相互作用、 MSC與不同成熟階段 的細胞相互作用直接對其生長、分化產(chǎn)生的影響等,目前還不清楚。 MSC的移植途徑: ① 直接側(cè)腦室注射,經(jīng)立體定位儀定位后進行側(cè)腦室穿刺,將擴增的 MSC移植于側(cè)腦室,使之隨腦脊液到達病變部位; ②腰穿椎管內(nèi)植入,將擴增的 MSC移植入蛛網(wǎng)膜下腔,使之隨腦脊液到達病變部位; ③直接注射,符合外科適應證的患者,在開顱后將擴增的 MSC直接注射到病變部位; ④靜脈移植,開放血腦屏障,將擴增 的 MSC靜脈輸入,使之通過血腦屏障到達病變部位。MSCs 分泌巨噬細胞集落刺激因子 (MCSF) 、 成纖維細胞生長因子 (fibroblast growth factor ,FGF) 、干細胞因子、轉(zhuǎn)化生長因子 β( TGFβ)等 ,還產(chǎn)生神經(jīng)細胞黏附分子 ( neural cell adhesion molecule ,NCAM) 和神經(jīng)生長因子 (NGF) 、 腦源性神經(jīng)生長因子 (BDNF) 等 ,這些細胞因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子是細胞得以存活、生長、分化的重要物質(zhì)。 MSCs 在體內(nèi)分化為神經(jīng)細胞 ,其機制可能更為復雜。 創(chuàng)傷腦組織提取液可產(chǎn)生一些生長因子如bFGF、 PDGF 等。 Jin 等應用 EGF、 FGF2 、 RA、 NGF 等不同組合 ,進行誘導 MSCs 分化 ,分化細胞形成神經(jīng)元樣突起 ,表達神經(jīng)元標志物 ,但是 ,不同生長因子誘導所表達的標志物在細胞內(nèi)的分布不同。 SanchezRamos 等使用了 EGF 或 BDNF 與視黃酸 (retinoicacid ,RA) 等組合將 MSCs 誘導為神經(jīng)元樣細胞。 MSCs 在體外分化研究中 , 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)能誘導MSCs 分化為神經(jīng)元的物質(zhì) ,包括一些抗氧化劑、神經(jīng)營養(yǎng)因子和生長因子以及損傷或正常的神經(jīng)組織勻漿上清液等。 研究證明, MSCs在不同的體外環(huán)境誘導下可向不同組織分化。SanchezRamous發(fā)現(xiàn)表皮生長因子或腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子可誘導人及小鼠 的少數(shù) MSC分化為神經(jīng)元樣及神經(jīng)膠質(zhì)細胞。因此有人推論 MSC的分化由特殊轉(zhuǎn)錄因子決定,不同的誘導條件可以決定其分化方向,可能是這些誘導條件啟動了決定分化方向的轉(zhuǎn)錄因子。 近期研究表明,在適宜的體內(nèi)或體外環(huán)境下MSC不僅可以分化為中胚層的間質(zhì)組織,還保持有內(nèi)外胚層的分化潛能,可分化為神經(jīng)細胞、肺臟、上皮等。應用單克隆抗體免疫組化的方法分析細胞的肌球蛋白重鏈、肌球蛋白輕鏈、肌動蛋白后發(fā)現(xiàn)這些細胞類似于胚胎心肌細胞。分離的細胞再加入 5azacytidine培養(yǎng) 24h ,篩選出自發(fā)跳動頻率最高的細胞約占細胞總數(shù)的 30 %。用 1 methyl3 isobutylxanthine、 地塞米松、胰島素及消炎痛處理 ,可成功誘導分化為細胞內(nèi)出現(xiàn)富集的脂質(zhì)小泡的脂肪細胞。 1999年 ,Pittenger等用地塞米松、 β 甘油磷酸等在體外培養(yǎng)條件下將其誘導分化成骨組織 。密度梯度離心法即根據(jù)骨髓中細胞成分比重的不同,提取單核細胞進行貼壁培養(yǎng)。MSC起源于中胚層 ,理論上講 ,它應可以向其它中胚層組織分化。 移植實驗 : 人胚胎干細胞 小鼠體內(nèi) 畸胎瘤 (良性 )→ 有三個胚層產(chǎn)生的組織: 胃上皮 (內(nèi)胚層 ) 骨、軟骨、平滑肌、橫紋肌等 (中胚層 ) 神經(jīng)表皮、神經(jīng)節(jié)復層磷狀上皮等 (外胚層 ) 骨髓干細胞 骨髓基質(zhì)干細胞( MSC) 的有關基礎研究及應用現(xiàn)狀 MSC具備干細胞的兩個重要特征 :強的自我增殖能力和多分化潛能。 2. 干細胞的理化特征與其 分化調(diào)控 有關 , 如上皮干細胞高表達 β1整合素 , 介導干細胞與細胞外基質(zhì)粘附 , 抑制干細胞分化 。 如小鼠胚胎干細胞表達胚胎階段性特異抗原 1(SSEA1), 不表達 SSEA3或 SSEA4; 人胚胎干細胞表達 SSEA3或 SSEA4。 : 如干細胞對 Hoechst33324和 Rhodamine 123染料不著色 。 離體培養(yǎng)可產(chǎn)生密集的多細胞克隆 。 分離 培養(yǎng) 培養(yǎng) 3. 體細胞移植 分化細胞核 (乳腺 、 皮膚細胞 ) 去核卵細胞→ 雜合細胞 發(fā)育成囊胚 胚胎干細胞 成體 (如多利羊 )。 發(fā)育 免疫切除法 培養(yǎng) 傳代 2. 從原始生殖細胞獲得 gearhart小組: 流產(chǎn)胎兒性腺嵴 原始生殖細胞 獲得 5個多能干細胞系 7個月不分化 。 4)在 37℃ 、 5%CO 飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。 3) 將分散的內(nèi)細胞團小塊吸置于培養(yǎng)孔內(nèi)。 胚胎干細胞無飼養(yǎng)層培養(yǎng) 1)用 %明膠水溶液處理 φ1cm的培養(yǎng)孔。 改用末端口徑比內(nèi)細胞團小的毛細吸管,輕輕吸吹內(nèi)細胞團塊,使之分散至 3~ 4個細胞在一起的小團塊。 7)用末端口徑比內(nèi)細胞團塊稍大的毛細吸管挑起內(nèi)細胞團,吸置消化液小滴內(nèi)。 每個平皿可做 20個消化液小滴。 5) 取 ,在平皿內(nèi)做消化液小滴。 3)繼續(xù)培養(yǎng) 2~ 4d, 內(nèi)細胞團繼續(xù)增大 4)將毛細吸管一端在火焰上拉細,用砂輪將末端切斷。 2)繼續(xù)培養(yǎng)。每天半量換液一次。 3)將收集好的 。在每等分內(nèi)加入胚胎干細胞培養(yǎng)液做成露滴狀液滴 ,每個液滴直徑為 ~ 1cm。,但也可能處于桑椹期,均可使用。 6)將盛有胚胎和沖卵液的平皿置于 50~100倍的解剖顯微鏡下。每側(cè)子宮注入沖卵液 ~ , 沖卵液會將胚胎沖出。 4) 用 1ml無菌注射器吸入沖卵液。 2)鑷住近子宮頸端并剪斷 ,分離子宮系膜 ,在輸卵管端剪斷子宮角。 3)第二天上午觀察母小鼠陰道栓,見栓當天上午確定為懷孕 , 見栓第四天為懷孕。 2) 隔 46~ 48hr腹腔注射人絨毛膜促性腺激素( HCG), 每只鼠 5~ 10IU。37℃ 、 5%CO 飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。 2)將分散的胚胎內(nèi)細胞團小塊吸置飼養(yǎng)層上。故使用絲裂霉素 C或 γ射線處理飼養(yǎng)細胞,使之終止分裂,同時仍分泌促進胚胎干細胞增殖和抑制其自主分化的因子,維持其未分化二倍體狀態(tài)。 細胞 可作為飼養(yǎng)層的細胞有二類 : 小鼠胚胎成纖維細胞 (MEF)和已建系的 SIM小鼠成纖維細胞耐 硫代鳥嘌呤和耐烏苯苷亞系 STO細胞。 無飼養(yǎng)層培養(yǎng)法則是利用各種能分泌抑制分化因子的細胞制備條件培養(yǎng)基,或在基礎培養(yǎng)基中加入重組的 LIF制備成條件培養(yǎng)基。 MEF 和 STO都能分泌促進胚胎干細胞增殖和抑制胚胎干細胞自主分化的因子。 目前體外培養(yǎng)胚胎干細胞的方法歸納起來有二大類:有飼養(yǎng)層培養(yǎng)法和無飼養(yǎng)層培養(yǎng)法。 胚胎干細胞 胚胎干細胞體外培養(yǎng)原理 胚胎干細胞體外培養(yǎng)的原則是 : 在促進胚胎干細胞增殖的同時,維持其未分化二倍體狀態(tài)。 當然,這種方法也有弊端:逆轉(zhuǎn)錄病毒這個運載工具畢竟是病毒,萬一它們在細胞里進行病毒復制,可能誘發(fā)腫瘤??蒲腥藛T在研究過程中使用了SOX CMYC和另一匿名基因修改人類成人皮膚細胞,成功將其改造成了 iPS細胞,并避免了腫瘤的產(chǎn)生。該研究小組用一種結(jié)構相近的名為「L-Myc」的轉(zhuǎn)錄基因取代這一基因制取人體干細胞,得到的干細胞數(shù)量是之前的 5倍,而且將這一技術應用于克隆活體小鼠實驗發(fā)現(xiàn),活體小鼠的死亡率降到了10%。該成果讓人們看到了 iPS細胞具有實用性。 2022年 7月, iPS細胞研究在臨床應用道路上又邁出非常重要的一步。 2022年 3月伊始, iPS細胞研究便相繼迎來兩項重大突破。 2022
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