【正文】 這為治療神經(jīng)退行性疾病提供了可能的方法。永生化神經(jīng)干細(xì)胞系可在體外長期大量增殖，同時可被轉(zhuǎn)染并在宿主體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)外源基因，將這些細(xì)胞植入損傷的神經(jīng)系統(tǒng)可作為基因治療的新策略。 Liang Peng等將人胚神經(jīng)干細(xì)胞移植到脊髓橫斷大鼠的病變區(qū)域， 3個月后，觀察到橫斷處神經(jīng)細(xì)胞軸突出現(xiàn)再生，運(yùn)動功能部分恢復(fù)。神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)為神經(jīng)損傷和腦退行性變的治療提供了可能的途徑。 BMP（ 骨架多型性蛋白）促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向星形膠質(zhì)細(xì)胞方向分化。 FGF2對神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞的祖細(xì)胞都有促分化作用，而 ECG僅對膠原祖細(xì)胞起作用。FGF－ 2（ 堿性成纖維細(xì)胞生長因子－ 2）在胚胎早期維持神經(jīng)祖細(xì)胞的的生存，促進(jìn)其增殖。 神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng) 從相應(yīng)的部位取出組織后，用機(jī)械吹打的方法或是胰酶消化的方法使之成為單細(xì)胞懸液，在含有 EGF和 /或 bFGF的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，一段時間以后，除干細(xì)胞外的其他細(xì)胞會逐漸死亡，而神經(jīng)干細(xì)胞則增殖形成克隆球。正常哺乳動物成年后，中樞神經(jīng)系統(tǒng)仍有神經(jīng)干細(xì)胞存在，只不過這些細(xì)胞平時處于靜止?fàn)顟B(tài)。目前， Nestin已被用于神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定。 目前得到普遍認(rèn)可的神經(jīng)干細(xì)胞的概念是由Mckay在 1997年提出的：神經(jīng)干細(xì)胞是指具有分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力，能自我更新并能提供大量腦組織細(xì)胞的細(xì)胞群。其后從成年鼠紋狀體、海馬齒狀回等處分離出能在體外不斷增殖，并具有向神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞分化潛能的細(xì)胞群。 神經(jīng)干細(xì)胞 關(guān)于神經(jīng)干細(xì)胞研究起步較晚，由于分離神經(jīng)干細(xì)胞所需的胎兒腦組織較難取材，加之胚胎細(xì)胞研究的爭議尚未平息，神經(jīng)干細(xì)胞的研究仍處于初級階段。 當(dāng)然，該領(lǐng)域的研究尚處于探索階段，目前還存在很多問題有待解決： (1)對 MSC本身特性的研究，它的真正起源，實際利用希望得到純的干細(xì)胞成分，但實驗證明體外的 MSC均為各種細(xì)胞的混雜，如何能夠獲得純的 MSC， 尚需進(jìn)一步研究； （ 2） MSC的增殖、分化的控制需要合適的條件，如何使既控制增殖，避免 發(fā)生腫瘤，又能在適當(dāng)?shù)臅r候啟動所需要的途徑進(jìn)行分化，有待于進(jìn)一步探索； （ 3） MSC間相互作用， MSC與造血干細(xì)胞間相互作用、 MSC與不同成熟階段 的細(xì)胞相互作用直接對其生長、分化產(chǎn)生的影響等，目前還不清楚。 MSC的移植途徑： ① 直接側(cè)腦室注射，經(jīng)立體定位儀定位后進(jìn)行側(cè)腦室穿刺，將擴(kuò)增的 MSC移植于側(cè)腦室，使之隨腦脊液到達(dá)病變部位； ②腰穿椎管內(nèi)植入，將擴(kuò)增的 MSC移植入蛛網(wǎng)膜下腔，使之隨腦脊液到達(dá)病變部位； ③直接注射，符合外科適應(yīng)證的患者，在開顱后將擴(kuò)增的 MSC直接注射到病變部位； ④靜脈移植，開放血腦屏障，將擴(kuò)增 的 MSC靜脈輸入，使之通過血腦屏障到達(dá)病變部位。MSCs 分泌巨噬細(xì)胞集落刺激因子 (MCSF) 、 成纖維細(xì)胞生長因子 (fibroblast growth factor ,FGF) 、干細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)化生長因子 β( TGFβ)等 ,還產(chǎn)生神經(jīng)細(xì)胞黏附分子 ( neural cell adhesion molecule ,NCAM) 和神經(jīng)生長因子 (NGF) 、 腦源性神經(jīng)生長因子 (BDNF) 等 ,這些細(xì)胞因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子是細(xì)胞得以存活、生長、分化的重要物質(zhì)。 MSCs 在體內(nèi)分化為神經(jīng)細(xì)胞 ,其機(jī)制可能更為復(fù)雜。 創(chuàng)傷腦組織提取液可產(chǎn)生一些生長因子如bFGF、 PDGF 等。 Jin 等應(yīng)用 EGF、 FGF2 、 RA、 NGF 等不同組合 ,進(jìn)行誘導(dǎo) MSCs 分化 ,分化細(xì)胞形成神經(jīng)元樣突起 ,表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)志物 ,但是 ,不同生長因子誘導(dǎo)所表達(dá)的標(biāo)志物在細(xì)胞內(nèi)的分布不同。 SanchezRamos 等使用了 EGF 或 BDNF 與視黃酸 (retinoicacid ,RA) 等組合將 MSCs 誘導(dǎo)為神經(jīng)元樣細(xì)胞。 MSCs 在體外分化研究中 , 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)能誘導(dǎo)MSCs 分化為神經(jīng)元的物質(zhì) ,包括一些抗氧化劑、神經(jīng)營養(yǎng)因子和生長因子以及損傷或正常的神經(jīng)組織勻漿上清液等。 研究證明， MSCs在不同的體外環(huán)境誘導(dǎo)下可向不同組織分化。SanchezRamous發(fā)現(xiàn)表皮生長因子或腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子可誘導(dǎo)人及小鼠 的少數(shù) MSC分化為神經(jīng)元樣及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。因此有人推論 MSC的分化由特殊轉(zhuǎn)錄因子決定，不同的誘導(dǎo)條件可以決定其分化方向，可能是這些誘導(dǎo)條件啟動了決定分化方向的轉(zhuǎn)錄因子。 近期研究表明，在適宜的體內(nèi)或體外環(huán)境下MSC不僅可以分化為中胚層的間質(zhì)組織，還保持有內(nèi)外胚層的分化潛能，可分化為神經(jīng)細(xì)胞、肺臟、上皮等。應(yīng)用單克隆抗體免疫組化的方法分析細(xì)胞的肌球蛋白重鏈、肌球蛋白輕鏈、肌動蛋白后發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞類似于胚胎心肌細(xì)胞。分離的細(xì)胞再加入 5azacytidine培養(yǎng) 24ｈ ,篩選出自發(fā)跳動頻率最高的細(xì)胞約占細(xì)胞總數(shù)的 30 %。用 1 methyl3 isobutylxanthine、 地塞米松、胰島素及消炎痛處理 ,可成功誘導(dǎo)分化為細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)富集的脂質(zhì)小泡的脂肪細(xì)胞。 1999年 ,Pittenger等用地塞米松、 β 甘油磷酸等在體外培養(yǎng)條件下將其誘導(dǎo)分化成骨組織 。密度梯度離心法即根據(jù)骨髓中細(xì)胞成分比重的不同，提取單核細(xì)胞進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。MSC起源于中胚層 ,理論上講 ,它應(yīng)可以向其它中胚層組織分化。 移植實驗 : 人胚胎干細(xì)胞 小鼠體內(nèi) 畸胎瘤 (良性 )→ 有三個胚層產(chǎn)生的組織： 胃上皮 (內(nèi)胚層 ) 骨、軟骨、平滑肌、橫紋肌等 (中胚層 ) 神經(jīng)表皮、神經(jīng)節(jié)復(fù)層磷狀上皮等 (外胚層 ) 骨髓干細(xì)胞 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（ MSC） 的有關(guān)基礎(chǔ)研究及應(yīng)用現(xiàn)狀 MSC具備干細(xì)胞的兩個重要特征 :強(qiáng)的自我增殖能力和多分化潛能。 2. 干細(xì)胞的理化特征與其 分化調(diào)控 有關(guān) ， 如上皮干細(xì)胞高表達(dá) β1整合素 ， 介導(dǎo)干細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)粘附 ， 抑制干細(xì)胞分化 。 如小鼠胚胎干細(xì)胞表達(dá)胚胎階段性特異抗原 1(SSEA1)， 不表達(dá) SSEA3或 SSEA4； 人胚胎干細(xì)胞表達(dá) SSEA3或 SSEA4。 ： 如干細(xì)胞對 Hoechst33324和 Rhodamine 123染料不著色 。 離體培養(yǎng)可產(chǎn)生密集的多細(xì)胞克隆 。 分離 培養(yǎng) 培養(yǎng) 3． 體細(xì)胞移植 分化細(xì)胞核 (乳腺 、 皮膚細(xì)胞 ) 去核卵細(xì)胞→ 雜合細(xì)胞 發(fā)育成囊胚 胚胎干細(xì)胞 成體 (如多利羊 )。 發(fā)育 免疫切除法 培養(yǎng) 傳代 2． 從原始生殖細(xì)胞獲得 gearhart小組： 流產(chǎn)胎兒性腺嵴 原始生殖細(xì)胞 獲得 5個多能干細(xì)胞系 7個月不分化 。 4）在 37℃ 、 5%CO 飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。 3） 將分散的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)小塊吸置于培養(yǎng)孔內(nèi)。 胚胎干細(xì)胞無飼養(yǎng)層培養(yǎng) 1）用 %明膠水溶液處理 φ1cm的培養(yǎng)孔。 改用末端口徑比內(nèi)細(xì)胞團(tuán)小的毛細(xì)吸管，輕輕吸吹內(nèi)細(xì)胞團(tuán)塊，使之分散至 3～ 4個細(xì)胞在一起的小團(tuán)塊。 7）用末端口徑比內(nèi)細(xì)胞團(tuán)塊稍大的毛細(xì)吸管挑起內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，吸置消化液小滴內(nèi)。 每個平皿可做 20個消化液小滴。 5） 取 ，在平皿內(nèi)做消化液小滴。 3）繼續(xù)培養(yǎng) 2～ 4d， 內(nèi)細(xì)胞團(tuán)繼續(xù)增大 4）將毛細(xì)吸管一端在火焰上拉細(xì)，用砂輪將末端切斷。 2）繼續(xù)培養(yǎng)。每天半量換液一次。 3）將收集好的 。在每等分內(nèi)加入胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液做成露滴狀液滴 ,每個液滴直徑為 ～ 1cm。，但也可能處于桑椹期，均可使用。 6）將盛有胚胎和沖卵液的平皿置于 50～100倍的解剖顯微鏡下。每側(cè)子宮注入沖卵液 ～ , 沖卵液會將胚胎沖出。 4） 用 1ml無菌注射器吸入沖卵液。 2）鑷住近子宮頸端并剪斷 ,分離子宮系膜 ,在輸卵管端剪斷子宮角。 3）第二天上午觀察母小鼠陰道栓，見栓當(dāng)天上午確定為懷孕 ， 見栓第四天為懷孕。 2） 隔 46～ 48hr腹腔注射人絨毛膜促性腺激素（ HCG）， 每只鼠 5～ 10IU。37℃ 、 5%CO 飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。 2）將分散的胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)小塊吸置飼養(yǎng)層上。故使用絲裂霉素 C或 γ射線處理飼養(yǎng)細(xì)胞，使之終止分裂，同時仍分泌促進(jìn)胚胎干細(xì)胞增殖和抑制其自主分化的因子，維持其未分化二倍體狀態(tài)。 細(xì)胞 可作為飼養(yǎng)層的細(xì)胞有二類 : 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞 (MEF)和已建系的 SIM小鼠成纖維細(xì)胞耐 硫代鳥嘌呤和耐烏苯苷亞系 STO細(xì)胞。 無飼養(yǎng)層培養(yǎng)法則是利用各種能分泌抑制分化因子的細(xì)胞制備條件培養(yǎng)基，或在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入重組的 LIF制備成條件培養(yǎng)基。 MEF 和 STO都能分泌促進(jìn)胚胎干細(xì)胞增殖和抑制胚胎干細(xì)胞自主分化的因子。 目前體外培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞的方法歸納起來有二大類：有飼養(yǎng)層培養(yǎng)法和無飼養(yǎng)層培養(yǎng)法。 胚胎干細(xì)胞 胚胎干細(xì)胞體外培養(yǎng)原理 胚胎干細(xì)胞體外培養(yǎng)的原則是 : 在促進(jìn)胚胎干細(xì)胞增殖的同時，維持其未分化二倍體狀態(tài)。 當(dāng)然，這種方法也有弊端：逆轉(zhuǎn)錄病毒這個運(yùn)載工具畢竟是病毒，萬一它們在細(xì)胞里進(jìn)行病毒復(fù)制，可能誘發(fā)腫瘤?？蒲腥藛T在研究過程中使用了SOX CMYC和另一匿名基因修改人類成人皮膚細(xì)胞，成功將其改造成了 iPS細(xì)胞，并避免了腫瘤的產(chǎn)生。該研究小組用一種結(jié)構(gòu)相近的名為「Ｌ－Ｍｙｃ」的轉(zhuǎn)錄基因取代這一基因制取人體干細(xì)胞，得到的干細(xì)胞數(shù)量是之前的 5倍，而且將這一技術(shù)應(yīng)用于克隆活體小鼠實驗發(fā)現(xiàn)，活體小鼠的死亡率降到了１０％。該成果讓人們看到了 iPS細(xì)胞具有實用性。 2022年 7月， iPS細(xì)胞研究在臨床應(yīng)用道路上又邁出非常重要的一步。 2022年 3月伊始， iPS細(xì)胞研究便相繼迎來兩項重大突破。 2022