形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)ppt課件(參考版)
2025-05-07 22:26本頁面
【正文】 在每次染色或每一批染色前，都應(yīng)列出實(shí)驗(yàn)計(jì)劃，做好免疫組化標(biāo)記記錄單，拿到的任何一種抗體都應(yīng)首先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定正式實(shí)驗(yàn)中抗原的修復(fù)方式、抗體的最佳稀釋度及孵育時(shí)間等，然后才能進(jìn)行大批的實(shí)驗(yàn)。用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果檢測的定量分析更為準(zhǔn)確。另一種方法是以 染色陽性強(qiáng)度和陽性檢出率相結(jié)合 而定，一般陽性細(xì)胞數(shù)在 0— 25%為陰性，25— 50%為陽性 +， 50— 75%為陽性 ++， 75%以上為陽性 +++。 ?Rb2/P130 有兩種方法：一是對(duì)檢測結(jié)果陽性細(xì)胞指數(shù)來定性。陽性細(xì)胞染色分布有三種類型 ① 胞漿；② 細(xì)胞核；③ 細(xì)胞膜表面。必須學(xué)會(huì)判斷特異性染色和非特異性染色，對(duì)初學(xué)者更為重要，否則會(huì)得出不科學(xué)的結(jié)論。因此，最好做內(nèi)源性過氧化物酶阻斷。 假陽性： 組織成分與染色試劑及抗血清之間的非特異結(jié)合稱假陽性。 ：用非免疫血清替代一抗。 陰性對(duì)照 1. 用確證不含已知抗原的標(biāo)本作對(duì)照，呈陰性結(jié)果。 陽性對(duì)照 用已知抗原陽性的標(biāo)本與待檢標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，對(duì)照切片應(yīng)呈陽性結(jié)果，稱為陽性對(duì)照。如 Actin、 CD34在正常組織中的血管壁肌層應(yīng)為陽性， Vimentin可選間質(zhì)細(xì)胞。主要是針對(duì)第一抗體對(duì)照，常用的對(duì)照方法包括：① 陽性對(duì)照；② 陰性對(duì)照；③ 阻斷試驗(yàn)；④ 替代對(duì)照；⑤ 空白對(duì)照；⑥ 自身對(duì)照；⑦ 吸收試驗(yàn)。也可用 1%2%甲基綠復(fù)染。 減少或消除非特異性染色的方法 非特異性著色 非特異性著色 根據(jù)所用的染色方法，可選用適當(dāng)?shù)膹?fù)染方法。 也可用除制備第一抗體以外的其它動(dòng)物血清 (非免疫的 )。必要時(shí)可加入 2%5% 牛血清蛋白，可進(jìn)一步減少非特異性染色。 組織中非抗原抗體反應(yīng)出現(xiàn)的陽性染色稱為非特異性背景染色，最常見的原因是蛋白吸附于高電荷的膠元和結(jié)締組織成分上。 37℃ 可增強(qiáng)抗原抗體反應(yīng)；適用于多數(shù)抗體染色，但應(yīng)注意在溫箱中進(jìn)行，防止切片干燥而導(dǎo)致失敗。 溫育時(shí)間 大部分抗體溫育時(shí)間為 3060min，必要時(shí)可 4℃ 過夜 (約 18h)?？贵w的過高及過低都可影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。 % mol/L枸櫞酸緩沖液， （ 8001500 ml）于壓力鍋中，大火加至沸騰，將脫蠟水化后的切片置于不銹鋼或耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中，蓋上鍋蓋，扣上壓力閥，繼續(xù)加熱至噴汽，即達(dá)到工作溫度和工作壓力（扣閥至噴汽以 6 min為最佳），開始計(jì)時(shí)， 12min后，壓力鍋離開熱源， 1 min后用自來水沖淋鍋體使之冷卻至室溫，去閥開蓋，取出玻片，蒸餾水沖，后用 PBS沖三次。 熱誘導(dǎo)的抗原修復(fù) 對(duì)大多數(shù)抗原有效，尤其是對(duì)核抗原的修復(fù)作用更為明顯，最常用的抗原修復(fù)液是 EDTA緩沖液，它們的作用原理是通過鈉離子的螯合而實(shí)現(xiàn)的。 蛋白酶消化 可以去除覆蓋抗原決定簇表面的雜蛋白，更為重要的是因甲醛固定而引起的交聯(lián)被打開而起暴露抗原決定簇的作用。 抗原修復(fù) (antigen retrieval， AR) 其作用是暴露抗原，增加細(xì)胞和組織的通透性，以便抗原抗體最大限度的結(jié)合，增加特異性染色，避免非特異性染色?？乖瓱嵝迯?fù)是甲醛固定組織后會(huì)使蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，尤其是蛋白質(zhì)分子苯環(huán)結(jié)構(gòu)上的結(jié)構(gòu)位置發(fā)生改變，從而使要檢測的抗原決定簇位點(diǎn)改變方向，通過高溫使抗原決定簇的位點(diǎn)恢復(fù)。b 免疫組化染色應(yīng)注意 ? 免疫組化染色方法已不是什么很難的問題，操作步驟簡單也易掌握 ,但要染好免疫組化 ,其中方法的技巧將是每位操作者在實(shí)際工作不斷摸索和探討的事 ,但最基本的應(yīng)從以下方面加以注意。 (%)顯色（鏡檢控制），水洗、復(fù)染、封片。 370C 孵育 30min或室溫 60min。 370C 60min或 40C過夜。 ％ H2O2甲醇液或 3％ H2O2室溫孵育 20min。此方法由于簡單、快速、敏感性強(qiáng)且避免了內(nèi)源性生物素所造成的背景染色，有逐漸取代其他免疫酶組織化學(xué)檢測方法的趨勢 。 。 特點(diǎn) : 。 4. 酶呈色反應(yīng)。 2. PBS洗 2次，每次 5 min。 特點(diǎn) :方法簡便，但靈敏度低。 （鏡檢控制），水洗、復(fù)染、封片。 1:100－ 1:150（ A和 B液于臨用前等量混合） 370C 60min或 40C過夜。 ，滴加適當(dāng)稀釋的一抗 370C 60min或40C過夜。 ％ H2O2甲醇液或 3％ H2O2室溫孵育 20min。 ％－ ％胰蛋白酶消化 30min。 3. 方法簡便 : 節(jié)約時(shí)間 ,PAP法需兩天 ,而 ABC法僅需幾小時(shí)。 ABC法 一、抗生物素 — 生物素 — 過氧化物酶復(fù)合法（ ABC）原理 特點(diǎn)： 1. 敏感性高 : 比 PAP法高 2040倍 ,這是由于生物素與抗生物素間有較強(qiáng)的結(jié)合力。 ABC復(fù)合物是將過氧化物酶結(jié)合在生物素上，再將生物素 過氧化物酶連接物與過量的抗生物素蛋白反應(yīng)而制備。 稱抗生物素 — 生物素系統(tǒng)。生物素（ biotin）即維生素 H。 基本染色流程：抗原抗體結(jié)合后，依次滴加第二抗體和 PAP復(fù)合物，最終形成 抗原 — 特異性一抗 — 第二抗體 — PAP復(fù)合物 PAP法原理 第四節(jié)親和免疫細(xì)胞化學(xué) 親和免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)（ affinity cytochemisty technique ） 是利用兩種物質(zhì)之間的高度親和能力而互相結(jié)合的化學(xué)反應(yīng)。此復(fù)合物穩(wěn)定性好，靈敏度高。因此，在酶標(biāo)記的基礎(chǔ)上，發(fā)展了不標(biāo)記抗體的免疫酶技術(shù)。由于在酶標(biāo)記過程中，酶與抗體之間的結(jié)合損害部分抗體和酶的活性，降低了抗體的效價(jià)。 上述免疫酶直接法和間接法屬 酶標(biāo)抗體法。 優(yōu)點(diǎn)：用途廣泛，只要標(biāo)記一種抗體，就可以檢測多種抗原。 優(yōu)點(diǎn)：簡單、省時(shí)、特異性高、非特異性染色較輕；缺點(diǎn)：敏感性差。酶的成色反應(yīng)取決于產(chǎn)生不同色素的底物（如 DAB）及適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件。 該方法將抗原抗體的免疫反應(yīng)與酶的高效催化作用原理有機(jī)地結(jié)合，通過酶催化底物進(jìn)而發(fā)生一系列的化學(xué)反應(yīng)，使溶液呈現(xiàn)出顏色反應(yīng)，從而顯示抗原抗體特異性反應(yīng)的存在。12小時(shí)后衰減 25％，一周后衰減 60％。 切片的觀察及保存 染色好的標(biāo)本應(yīng)立即在熒光顯微鏡下進(jìn)
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1