基因的重組ppt課件(參考版)
2025-05-01 22:39本頁面
【正文】 其機理可能是（ 1） DEAE葡聚糖同 DNA結(jié)合成復(fù)合物，可以保護 DNA免受合算酶的降解作用；（ 2） DEAE葡聚糖可以同細(xì)胞膜發(fā)生作用，從而使 DNA能夠容易地穿過細(xì)胞表面進入細(xì)胞內(nèi)部 DEAEdextran 細(xì)胞 外源 DNA 預(yù)處理 攝入 DEAEdextran 外源 DNA 細(xì)胞 混合 DEAEdextran對細(xì)胞有毒 ! 名稱 機制 轉(zhuǎn)染效率 用途 優(yōu)缺點 影響因素 磷酸鈣轉(zhuǎn)染法 內(nèi)吞作用 20%細(xì)胞被轉(zhuǎn)染 瞬時表達 簡單有效 適用于貼壁、非貼壁細(xì)胞 常作首選方法 Ca2 ， DNA濃度 PH值，沉淀反應(yīng)時間 氯喹，甘油和丁酸鈉處理 DEAE葡聚糖轉(zhuǎn)染法 抑制核酸酶 內(nèi)吞作用 在 BDC1， CV1和 COS細(xì)胞中較高 瞬時表達 操作簡單 需高濃度 DNa DEAE葡聚糖濃度 溫育時間 Polybrene轉(zhuǎn)染法 不清楚 低分子量 DNA轉(zhuǎn)染率高于磷酸鈣法 CHO細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子 能得到較多的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子 受體細(xì)胞類型 轉(zhuǎn)染調(diào)控信號 DNA濃度 原生質(zhì)體融合 胞膜融合 50100%轉(zhuǎn)染，穩(wěn)定子得率為% 瞬時表達 穩(wěn)定表達 操作復(fù)雜 不能進行共轉(zhuǎn)染 慎用于篩選營養(yǎng)缺陷型變異株 溶菌酶、 PEG濃度 溫育時間 電穿孔 高壓在膜上形成微孔 效率較高 瞬時表達 穩(wěn)定轉(zhuǎn)化 需精密儀器 可用于動物、植物細(xì)胞和細(xì)菌 電場強度 脈沖長度 溫度， DNA濃度 培養(yǎng)液 脂質(zhì)體 脂膜融合 5060%轉(zhuǎn)染 瞬時表達 穩(wěn)定轉(zhuǎn)化 操作簡單 可用于體內(nèi)試驗 脂質(zhì)體質(zhì)量 DNA濃度 胞核微注射法 直接注射 50100%轉(zhuǎn)染 穩(wěn)定轉(zhuǎn)化 需要特殊儀器 處理樣品數(shù)量少 高效 注射技術(shù) DNA濃度 外源基因?qū)爰?xì)胞的方法 18 。 3. 顯微注射法 (microinjection) 二乙氨乙基（ diethylaminoehtyl， DEAE）葡聚糖簡稱 DEAE葡聚糖 它是一種高分子量的多聚陽離子試劑，能促進哺乳動物細(xì)胞攝入外源 DNA。 mRNA表達最高； 72h蛋白表達最高。濃度不要低于 。 5~6小時更換全培養(yǎng)基。注意洗的時候要輕，靠邊緣緩緩加入液體，然后不要吹吸細(xì)胞，而是轉(zhuǎn)動培養(yǎng)板讓液體滾動在細(xì)胞表面。 細(xì)胞的融合度必須要達到 90%才能做，細(xì)胞太少，容易死的。我總是在細(xì)胞復(fù)蘇后的 3代左右做，那時細(xì)胞狀態(tài)最好，不要用傳了很多代的細(xì)胞去做，細(xì)胞的形態(tài)都會發(fā)生變化了。這點非常重要，不要急于求成，一定要讓細(xì)胞處于最佳的生長狀態(tài)再做。以下是個人經(jīng)驗，與大家分享。 內(nèi)部水腔 雙層膜 我覺得貼壁細(xì)胞的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染還是很容易的，有了經(jīng)驗之后，現(xiàn)在做轉(zhuǎn)染得心應(yīng)手，轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞的形態(tài)幾乎不發(fā)生變化，幾乎沒有細(xì)胞死亡。 2. 脂質(zhì)體（ lipofectin）載體法 脂類包埋 DNA，通過細(xì)胞膜進入細(xì)胞。 （ 2）特點： 將待轉(zhuǎn)染的外源 DNA同 cacl2 混合制成 cacl2 –DNA溶液 在不斷攪拌過程中，逐滴加入磷酸鈣溶液，形成磷酸鈣和 DNA共沉淀 然后，直接用吸管仔細(xì)轉(zhuǎn)移共沉淀，使之粘附到培養(yǎng)的哺乳動物單層細(xì)胞表面，就會迅速地被細(xì)胞捕獲。 依據(jù)不同的細(xì)胞類型，平皿上最多能有 10%的細(xì)胞能吸收 DNA沉淀。 轉(zhuǎn)化 酵母 插入外源基因的酵母載體 感受態(tài) 40% PEG 4000 （ 2）利用 Li+鹽進行轉(zhuǎn)化 PEG（聚乙二醇）使 細(xì)胞壁 具有通透性，允許DNA進入，還可使細(xì)胞膜之間以及細(xì)胞膜與 DNA之間形成分子橋，促使相互間的接觸和粘連。 （ 2）感受態(tài)細(xì)胞 （ petent cells) 轉(zhuǎn)化率高的菌株； 有突變的菌株（與導(dǎo)入的載體基因互補）； 不育的菌株（不會與其他酵母接合）。 要充分，使細(xì)菌細(xì)胞膜失去一些蛋
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