南農(nóng)生物分離工程生物分離7親和(參考版)
2025-01-16 12:34本頁面
【正文】 。 rhIFN α的比活提高了1150倍 ， 收率達 95％ 。 ? 色素親和色譜 、 固定化金屬離子親和色譜和免疫親和色譜可用于 IFN的純化 。 圖 53 精氨酸 Sepharose 4B 親和色譜 2. 干擾素的純化 ? 干擾素（ interferon， IFN） 對癌癥、肝炎等疾病具有特殊療效。 ? 圖 53是利用精氨酸 Sepharose 4B親和色譜法純化豬心組織 tPA的結果。 “負洗脫 ”：酶必須先結合 A才能結合 B，一般選 A 作配基，若選 B作配基，流動相含 A， 洗脫時不含 A 如 NADH使乳酸脫氫酶吸附在固定化丙酮酸類似物上，洗脫液中不含 NADH，脫氫酶被洗脫 再生 通常無需再生 非特異性吸附由于變性蛋白沉積，用 6mol/L脲 提純 tPA、干擾素 干擾素：細胞誘導產(chǎn)生，雜蛋白多， (NH4)2SO4 沉淀，凝膠過濾，離交，電泳，產(chǎn)率 10% 親和層析，一步提純 3600倍，活力回收率高 應用舉例 1. tPA的純化 ? 組織纖溶酶原激活劑（ tPA）是一種糖蛋白，具有激活纖溶酶原、促進血纖維蛋白溶解的作用，是治療血栓等心腦血管疾病的蛋白藥物。 “ 正洗脫 ” 常用游離配基抑制劑、輔酶、底物、結構類似物 ? 利用 con A為配基的目標產(chǎn)物可用葡萄糖溶液洗脫。 純化幾個酶 抗原抗體降低緩沖液極性（加乙二醇） 加蛋白變性劑，洗脫后稀釋透析 ? 親和色譜洗脫方法 ? 特異性洗脫法 ? 利用含有與親和配基或目標產(chǎn)物具有親和結合作用的小分子化合物溶液為洗脫劑，通過與親和配基或目標產(chǎn)物的 競爭性結合 ，脫附目標產(chǎn)物。具體方法如下： ? 碳二亞胺縮合法 ? 酸酐法 ? 疊氮化法 ? 重氮化法 吸附和洗脫 一、影響吸附的條件 ? 平衡緩沖液 平衡固定相，保持 pH， I 平衡流動相，接近生理條件 洗滌，洗脫 近中性 pH、低 I或添加輔因子 ? 吸附溫度 ＜ 10℃ ? 樣品 1. 吸附容量 圖 因素：吸附劑、條件 吸附容量一般小于配基濃度 1/100 前沿分析法 2. 樣品濃度 親和力大，濃度不重要，太濃影響擴散，專一性下降 親和力小，濃度 ↑親和效果 ↑峰集中 一般蛋白＜ 3% ? 吸附平衡的流速 大分子配體與配基的吸附平衡需較長時間 高溫數(shù)小時，低溫數(shù)天 操作：先平衡、低流速＜ 10ml/c㎡ ? 引入間隔臂的長度是有一定限制的，當間隔臂超過一定長度時，配基與目標分子的親和力又會減弱。 ? 事實上，除 CNBr活化法外，其他活化法都引入了不同的活性基因，這些活性基團如果有適當?shù)拈L度，都可起到間隔臂的作用。 這時，需要在配基 與載體之間連接一 個“間隔臂（ spacer）”， 使其發(fā)生有效的親 和結合。常用的活化試劑為 1,4丁二醇 二縮水甘油醚（ BGE）和環(huán)氧氯丙烷。反應過程為： ? 活化步驟 瓊脂糖與等量水混合，溴化氰充分粉碎， 濕膠 ︰ CNBr=1020 ︰ 1， 1820℃ ， 177。 親和吸附載體的種類 種類 組成 性能 多孔玻璃載體 硅酸鹽 堅硬、耐酸堿、易修飾 聚丙烯酰
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