【正文】 本科畢業(yè)設(shè)計(jì) 第 14 頁 共 58 頁 4 透明質(zhì)酸的 工藝 透明質(zhì)酸的發(fā)酵機(jī)制 一般采用的菌種為獸疫鏈球菌（ Streptococcus zooepidemicus），該菌。 綜上考慮，該地區(qū)是建廠的極好選擇。供電條件較好。京山 、京秦、大秦三條鐵路橫貫東西，五個(gè)火車站均勻 分布；公路四通八達(dá)，京山、京秦、三撫 干線公路 環(huán)繞四周，鄉(xiāng)級(jí)公路 1992 年全部實(shí)現(xiàn)油路化。盧龍素有養(yǎng)豬的傳習(xí)慣，牛、羊、雞、鴨、鵝等畜發(fā)展較快，幾年前盧龍已被確認(rèn)為全國奶山羊、商品牛基地縣。從長遠(yuǎn)看，薯類產(chǎn)品原料豐富，逐步由傳統(tǒng)加工向深層次、綜合開發(fā)發(fā)展。正在研制開發(fā)的有 L 型乳、檸檬酸、總?cè)軇?、酒精、醫(yī)藥、植物膠、變性淀粉、飴糖、蛋苕酥等化工品和食品；加工的食品有 淀粉 、粉條、 粉絲 、粉皮、罐頭、薯脯、薯醬、冷、薯 葉柄 、薯?xiàng)?、膨化薯片等。以甘薯為原料搞多層次加工已形成?guī)模。 農(nóng)產(chǎn)品豐富多樣，農(nóng)物有甘薯、玉米、小麥、水稻、花生、大豆等。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)條件好。目前，全縣鄉(xiāng)鎮(zhèn)企業(yè)中農(nóng)用汽車系列、璃纖維制品系列填補(bǔ)了省內(nèi)空白，汽車內(nèi)裝飾板、檸檬酸鈉、電教器材等填了國內(nèi)空白。工業(yè)企業(yè)尤以石、水泥、陶瓷等產(chǎn)品為主的建材業(yè)發(fā)展較快。主要產(chǎn)品有 350多種，有 31種達(dá)到省級(jí)以上標(biāo)準(zhǔn)。工業(yè)門類比較齊全，現(xiàn)已初步形成符合當(dāng)?shù)靥攸c(diǎn)的生產(chǎn)體系。主要產(chǎn)品 350 多種，全縣有鄉(xiāng)鎮(zhèn)企業(yè) 1 萬多家，從業(yè)近 5 萬人， 1998 年總產(chǎn)值 24億元。盧龍縣工業(yè)門類較為齊全，現(xiàn)已初步形成符合當(dāng)?shù)靥厣纳a(chǎn)體系。 經(jīng)濟(jì)概況 到 1998年底，全縣國內(nèi)生產(chǎn)總值達(dá)到 億元，其中一、二、三次產(chǎn)業(yè)增加值分別為 億元、 億元、 億元，第三產(chǎn)業(yè)增加值占國內(nèi)生產(chǎn)總值的%；社會(huì)商品零售額達(dá)到 57091萬元；縣財(cái)政收入實(shí)現(xiàn) 8519萬元 ，其中地方性財(cái)政收入 6397 萬元。盧龍縣水資源豐富。果品產(chǎn)量 7200多萬噸，以 “ 石門核桃 ” 最為有名。主要礦產(chǎn)資源具有很好的開發(fā)條件。建筑砂儲(chǔ)量 ，碳酸鈣含量 80%以上的石灰石儲(chǔ)量 億噸，花崗巖儲(chǔ)量 30 萬立方米，白云石、硅石、重晶石等儲(chǔ)本科畢業(yè)設(shè)計(jì) 第 12 頁 共 58 頁 量也很豐富。盧龍縣有豐富的礦產(chǎn)資源。 自然資源 盧龍縣屬 暖溫帶大陸性季風(fēng)氣候 區(qū)，四季分明。08’ 之間。08’ 、北緯 39176。 盧龍縣地處 河北省 東北部，位于東經(jīng)118176。 因此，生物工程工廠的廠址選擇，涉及面廣，必須綜合考慮、慎重對(duì)待，要按經(jīng)濟(jì)規(guī)律辦事，以有利于建設(shè)事業(yè)。除了鐵路和公路運(yùn)輸外，在有條件應(yīng)優(yōu)先考慮水運(yùn)，以降低運(yùn)輸成本。選擇廠址，必須以交通運(yùn)輸方便為原則。并有利于生物工程工廠的環(huán)境衛(wèi)生。 ②動(dòng)力供應(yīng)條件 廠址應(yīng)具有滿足生產(chǎn)、生活及發(fā)展規(guī)劃所必需的水源和電源，并靠近水源、電源。 ⑵技術(shù)經(jīng)濟(jì)條件 ①原料、輔料等供應(yīng)條件 在生物工程產(chǎn)品的生產(chǎn)過程中，原料消耗非常多，特別是糧食、燃料及一些化工原料。如無法避免這些地區(qū)則一定要位于污染源和全年主導(dǎo)風(fēng)向的上風(fēng)側(cè)，且有本科畢業(yè)設(shè)計(jì) 第 11 頁 共 58 頁 足夠的防護(hù)距離。 因此，生物生產(chǎn)企業(yè)廠址應(yīng)設(shè)在周圍自然環(huán)境較清潔、大氣含塵、含菌濃度低、無有毒有害氣體污染、 綠化較好的地形、地貌有利于生產(chǎn)、節(jié)能的區(qū)域。 ⑥環(huán)境衛(wèi)生條件 生物工程產(chǎn)品中不少是醫(yī)藥產(chǎn)品或食品，所以對(duì)工廠周圍的環(huán)境有嚴(yán)格要求。水資源狀況包括：地下水（深水井）、泉水（有壓力）；地表水（江河、水庫）、城市自來水的水源狀況；了解相當(dāng)?shù)男钏? ，水量供水量、水價(jià) 以及有關(guān)供應(yīng)協(xié)議，取水點(diǎn)、水質(zhì)情況（分析報(bào)告）等。還要考慮冰凍線對(duì)建筑物基礎(chǔ)和地下管線敷設(shè)的影響。 ④氣象條件 氣象條件包括風(fēng)向、風(fēng)量、雨量和氣溫等，要考慮高溫、高濕、云霧、風(fēng)沙和雷擊地區(qū)對(duì)生產(chǎn)的不良影響，這些有關(guān)影響空氣質(zhì)量的因素，對(duì)生物工程企業(yè)尤為重要。如在寒冷地區(qū)建廠還要注意凍土層情況。 ③地質(zhì)條件 應(yīng)避開地震斷層、泥石流、滑坡、流沙、溶洞、沼澤等危害地段，以及具有開采價(jià)值的礦藏區(qū)、采空區(qū)，以及古井、古墓、坑穴密集的地區(qū)。如在山區(qū)建廠，還要注意周圍塌方、滑坡和泥石流等問題。對(duì)平原地區(qū)，自然 地本科畢業(yè)設(shè)計(jì) 第 10 頁 共 58 頁 形坡度不小于 %為宜，對(duì)于丘陵地區(qū)、山區(qū)，地勢(shì)以不大于 5%為宜。地勢(shì)要求以基本平坦、略有坡度為佳。以矩形場地為最佳，以利于總平面布置。 (1)自然條件 ①地理位置 選擇廠址時(shí)應(yīng)當(dāng)了解所選廠址的方位及其與城鎮(zhèn)的關(guān)系，并考慮生物工程工廠生產(chǎn)方式及產(chǎn)品銷售細(xì)的特點(diǎn)。 第三，使企業(yè)接近原料、能源產(chǎn)地和產(chǎn)品消費(fèi)區(qū)，消除不合理運(yùn)輸；總體經(jīng)濟(jì)效 益好，有利于加快國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人民生活水平的提高。 第二，充分利用各地區(qū)的有利條件，避開或克服不利條件；充分利用當(dāng)?shù)厝肆Α⑽锪?、?cái)力和自然資源，保護(hù)環(huán)境；節(jié)約用地，不占用良田及經(jīng)濟(jì)效益高的土地，并符合國家現(xiàn)行土地管理、環(huán)境保護(hù)、水土保持等法規(guī)有關(guān)規(guī)定。生物發(fā)酵工廠建廠地區(qū)的選擇應(yīng)當(dāng)有利于發(fā)酵工業(yè)的合理布局，有利于地區(qū)經(jīng)濟(jì)和國民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，應(yīng)當(dāng)考慮合理利用現(xiàn)有的工業(yè)基地和交通運(yùn)輸條件，或適應(yīng)新工業(yè)基地和中小城鎮(zhèn)建設(shè)的需要，考慮生產(chǎn)和技術(shù)協(xié)作的條件，為原材料供應(yīng)、產(chǎn)品配套、工藝協(xié)作、科學(xué)技術(shù)協(xié)作和信息交流等創(chuàng)造有利條件。 7H2O %， K2HPO4 %，調(diào) ， 115℃滅菌 20min。 7H2O %， K2HPO4 %，調(diào) pH ， 115℃ 滅菌 20min。 本科畢業(yè)設(shè)計(jì) 第 7 頁 共 58 頁 2 設(shè)計(jì)的內(nèi)容和依據(jù) 設(shè)計(jì)題目 年產(chǎn) 10噸透明質(zhì)酸發(fā)酵生產(chǎn)工藝 設(shè)計(jì) 設(shè)計(jì)依據(jù) 河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院生物工程系下達(dá)的 2022屆畢業(yè)設(shè)計(jì)任務(wù)書。通過口服透明質(zhì)酸來增加體內(nèi)的含量 ，來補(bǔ) 充人體內(nèi)透明質(zhì)酸的不足。透明質(zhì)酸與其他藥物反應(yīng)形成 的化合物對(duì)藥物發(fā) 揮緩釋作用，可達(dá)到定向和定時(shí)釋放的目的。另外， 透明質(zhì)酸鈉可作為滑潤劑潤濕眼球表面，防止上皮干燥 ，常用于治療干燥性角結(jié)膜炎 (干眼病 )等。 ( 三 ) 在藥物中的應(yīng)用 透明質(zhì)酸作為媒介在滴眼液中廣泛應(yīng)用， 不僅起到 了增稠的作用 ， 還可增加藥物的生物利用度 ， 并減輕藥 物對(duì)眼的刺激， 促進(jìn)眼部創(chuàng)傷愈合， 迅速緩解眼部不適。 ( 二 ) 在臨床方面的應(yīng)用 透明質(zhì)酸是構(gòu)成人體細(xì)胞間質(zhì)、眼玻璃體、關(guān)節(jié)滑液等結(jié)締組織的主要成分，在體內(nèi)發(fā)揮保水、維持細(xì)胞外空間、 調(diào)節(jié)滲透壓 、 潤滑、 促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)的重要生理功能。透明質(zhì)酸的水溶液具有很高的黏度，可使水相增稠 ， 使油相乳化后的膏體均勻細(xì)膩， 具有穩(wěn)定乳化作用。 透明質(zhì)酸的市場 前景 ( 一 ) 在化妝品方面的應(yīng)用 透明質(zhì)酸作用于皮膚表 面，大分子透明質(zhì)酸可在皮膚表面形成一層透氣的薄膜 ， 使皮膚光滑濕潤， 并可阻隔外來細(xì)菌、 灰塵 、 紫外線的侵入 ， 保護(hù)皮膚免受侵害； 小分子透明質(zhì)酸能滲入真皮 ， 具有輕微擴(kuò)張毛細(xì)血管增加血液循環(huán)、 改善中間代謝、 促進(jìn)皮膚營養(yǎng)吸收、 消皺增加皮膚彈性、 延緩皮膚衰老等作用。發(fā)酵工藝的研究發(fā)酵工藝是影響 HA 分子量和產(chǎn)量的重要因素，適宜的發(fā)酵工藝有利于微生物自身的生長，同時(shí)又可以使代謝最大程度地向著 HA 合成的方向進(jìn)行，極大地提高了微生物對(duì)底物的利用效率。擇優(yōu)采用含有質(zhì)粒 SJR3 的菌株進(jìn)行發(fā)酵罐培養(yǎng)，在適宜條件下培養(yǎng)， HA產(chǎn)量達(dá)到／Ｌ。 Chien 等將獸疫鏈球菌 HA合成酶基因 和馬疫鏈球菌 UDP－葡萄糖脫氫酶基因分別導(dǎo)入到乳酸乳球菌中，得到新的重組菌株， HA 產(chǎn)量達(dá)到 ／Ｌ。研究表明， has操縱子在鏈球菌中的表達(dá)是合成莢膜所必需的， has 操縱子是由 hasA、 hasB 和 hasC 三個(gè)基因組成，分別編碼著 HA 合成酶、 UDP－葡萄糖脫氫酶和 UDP－葡萄糖焦磷酸化酶，只要將 HA合成酶基因和 UDP－葡萄糖脫氫酶基因轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中，在合適的培養(yǎng)和誘導(dǎo)條件下，即可產(chǎn)生HA 合成酶和 HA。魏甲乾等采用重離子和紫外誘變相結(jié)合的方法對(duì) 獸疫鏈球菌進(jìn)行誘變，使突變菌株產(chǎn)透明質(zhì)酸能力提 高了 3倍 多 產(chǎn)率穩(wěn)定在 ～ ／Ｌ。葉倩文等采用超聲波法和紫外線復(fù)合誘變處理得到突變菌株，該菌株的 HA產(chǎn)量較原菌株 HA 產(chǎn)量由原菌株的 ／Ｌ 提高到 ／Ｌ。鄧靜等采用復(fù)合誘變方式對(duì)獸疫鏈球菌先紫外誘變處理 90s，然后微波處理100s，得到的突變菌株較原始菌株產(chǎn) HA由 ／Ｌ提高到 ／Ｌ。 (1)誘變育種的研究 誘變劑主要包括物理誘變劑和化學(xué)誘變劑，現(xiàn)階段用作 HA 菌種誘變因子主要有紫外線、亞甲 基胍 （ NTG） 、溫度、 60℃ －γ射線和重離子等。研究表明鏈球菌屬的多種細(xì)菌都有莢膜，這種莢膜的主要成分就是 HA，能夠產(chǎn)生 HA 的鏈球菌屬 多為 A群和 C群，由于 A群致病性強(qiáng)，較少用作菌種， C群致病性較弱，目前多采用此類菌進(jìn)行生物發(fā)酵，現(xiàn)階段多采用 C群的獸疫鏈球菌、馬疫鏈球菌、類馬疫鏈球菌作為 HA的生產(chǎn)菌。 在進(jìn)入透明質(zhì)酸純化階段后，離子交換法往往被采用，因?yàn)殡x子交換層析分離條件溫和，不會(huì)引起分子結(jié)構(gòu)的變化，已經(jīng)成為分離提純生物大分子的有效方法。 ( 3 ) 透明質(zhì)酸的純化工藝。膜技術(shù)不僅可以用于發(fā)酵液的濃縮， 將其作為一種主體技術(shù)分離 、 提純發(fā)酵液中的透明質(zhì)酸也有一定可行性。乙醇添加量一般是發(fā)酵液體積的 2 倍舊 ， 如果乙醇添加量足夠大， 透明質(zhì)酸濃度低至0 ． 1 ％也可以完全沉淀 。 除去發(fā)酵液中的菌體后，需要將透明質(zhì)酸分離出來 ， 這是一個(gè)初步純化過程。過濾除菌法是物理過程， 操作簡便 ， 效果明顯， 并且容易在工業(yè)化生產(chǎn)中應(yīng)用，在發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液加人工業(yè)乙醇得到透明質(zhì)酸粗品沉淀，以 2 0 g ／ L 的濃度溶于去離子水 ， 加入硅藻土 ， 充分?jǐn)嚢枰晕骄w雜質(zhì)， 在 p H 4 ． 6 — 4 ． 8 下過濾， 濾液在 p H 為 4 ． 8 時(shí)濁度最低， 蛋白質(zhì)在 p H4 ． 6 時(shí)含量最低。 除菌的方法也有很多， 相對(duì)于鹽酸法、 甲醛法。常用的滅菌劑包括三氯乙酸、 氯仿等。 ( 1 ) 預(yù)處理。 分離純化的主要 目的是獲得純度較高的透明質(zhì)酸， 目前國內(nèi)外一般以葡萄糖醛酸含量表示透明質(zhì)酸的純度， 保健品及化妝品中透明質(zhì)酸的葡萄糖醛酸含量為 3 5 ％一 4 5 ％ ，藥用級(jí)別為 4 2 ％ ～ 4 8 ％ t 4 J 。發(fā)酵液中加人少量尿嘧啶、 谷氨酰胺和天冬氨酸， 或加入溶菌酶 ， 也能提高透明質(zhì)酸產(chǎn)量。溫度通常為 3 7 ~ C， 在不同發(fā)酵階段 采用不同的溶氧量 ，也可提高透明質(zhì)酸的產(chǎn)率。 透明質(zhì)酸發(fā)酵有需氧發(fā)酵和厭氧發(fā)酵， 有氧發(fā)酵一般產(chǎn)率高且分子量高。碳源主要是各種單糖、蔗糖 和淀粉水解物，最常用的是葡萄糖，還有磷酸鹽、硫酸鹽等無機(jī)鹽。 本科畢業(yè)設(shè)計(jì) 第 3 頁 共 58 頁 2 ．培養(yǎng)基的選配及發(fā)酵工藝的優(yōu)化。目前所用的菌種主要有獸疫鏈球菌、 馬疫鏈球菌和類馬疫鏈球菌等『 2 J 。生物發(fā)酵法具有產(chǎn)品不受原料資源限制、 生產(chǎn)成本低、 工藝簡單等特點(diǎn)， 是今后研究開發(fā)的方向。隨著透明質(zhì)酸應(yīng)用范圍的不斷擴(kuò)大，該方法已不能滿足醫(yī)藥和化妝品生產(chǎn)的需求，必將逐漸被發(fā)酵法所取代。豬皮中含脂肪較多，且韌性很大，不易絞碎，一般用 NaOH 溶液 37℃保溫使豬皮液化后用 50％的乙醇調(diào)中性，豬皮透明質(zhì)酸得率為 ％。臍帶脂肪含量較雞冠高，可用稀堿溶液 (pH8) 6O℃熱提數(shù)次，或用水一氯仿溶液 (20： 1 ) 提取并用等體積氯仿洗滌提取液進(jìn)一步脫脂， 臍帶透明質(zhì)酸產(chǎn)量約為 ％。不同組織透明質(zhì)酸的提取純化過程有一定的差別。 從動(dòng)物組織中提取透明質(zhì)酸的一般過程如下：先將組織勻漿，再用水和稀鹽溶液提??； 提取用氯代十六烷基吡啶或十六烷基三甲基溴化銨沉淀；將所得的沉淀溶解除渣后，用 2～ 3 倍乙醇沉淀所得粗品。低濃度的 HA 溶液主要表現(xiàn)為粘性 , 而高濃度溶液則主要顯示其彈性 。 HA 水溶液是一種非牛頓型流體 , 有著良好的粘彈性和應(yīng)變性。由于直鏈鏈軸上單糖之間氫鍵的作用 ,HA 分子在空間呈剛性的螺旋柱型 , 其半徑為 200nm , 柱內(nèi)側(cè)因有大量羥基而產(chǎn)生強(qiáng)親水性。 在醫(yī)藥方面，透明質(zhì)酸（玻尿酸） HA 用于非甾體消炎藥，關(guān)節(jié)炎治療，眼科，心外科手術(shù)的輔助藥品，在治療燙傷、燒傷、本科畢業(yè)設(shè)計(jì) 第 2 頁 共 58 頁 凍傷、 人造皮膚 等方面，有著獨(dú)到的作用 透明質(zhì)酸的合成原理 HA 是由相同的二糖單體重復(fù)排列而形成的無支鏈的直鏈多聚物 , 其中每個(gè)二糖單體由一個(gè) N— 乙酰氨基葡萄糖 (GlcNac) 以β 1,3 糖苷鍵與葡萄糖醛酸( GIc A ) 交替連接而成 , 二糖單位間以β 1,4糖苷鍵連接。因?yàn)橥该髻|(zhì)酸的自身的特性，能使細(xì)胞保