【正文】 從細(xì)胞中提取SOD酶，制成商品已應(yīng)用于抗衰老，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能上。在治療上，應(yīng)用胸腺素、轉(zhuǎn)移因子、 ILγ 干擾素以及多糖類中藥等都可提高紅細(xì)胞免疫功能，促進(jìn)機(jī)體恢復(fù)正常。 如硬皮病 、 原發(fā)性癲癇 、 銀屑病等患者的紅細(xì)胞免疫功能表現(xiàn) 。 ? （ 2） 失代償紅細(xì)胞免疫功能缺陷或原發(fā)性紅細(xì)胞免疫功能缺陷： ? 其表現(xiàn)為紅細(xì)胞 C3b受體花環(huán)率和紅細(xì)胞免疫復(fù)合物花環(huán)率均下降 ， 如少數(shù) SLE、PNH、 慢性化膿性骨髓炎等患者的紅細(xì)胞免疫功能表現(xiàn) 。 如自身免疫性疾病 、 腫瘤 、 傳染病 、 變態(tài)反應(yīng)病 、 老年病 、 內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病等 ，以及外傷 、 創(chuàng)傷 、 感染 、 溫度 、 血液庫(kù)存時(shí)間等因素均可導(dǎo)致紅細(xì)胞免疫功能的變化 。 紅細(xì)胞免疫在臨床應(yīng)用的研究 ? 紅細(xì)胞免疫發(fā)展的顯著特點(diǎn) ， 就是人們?cè)谥匾暭t細(xì)胞免疫基礎(chǔ)理論和實(shí)驗(yàn)方法研究的同時(shí) ， 也重視了臨床應(yīng)用的研究 ，將紅細(xì)胞免疫與臨床各科疾病緊密地結(jié)合起來(lái) 。 ? （ 8） 除上述方法外 ， 還可根據(jù)紅細(xì)胞膜上 C3b受體在血清 I因子滅活 C3b時(shí)起輔因子的作用采用酶活性測(cè)定法 （ Enzymic assay， EA） ：將人 C3b分離出來(lái)用 125碘標(biāo)記 ， 加入固定濃度的 I因子 ， 再加人待測(cè)紅細(xì)胞或紅細(xì)胞膜的提取物 ，37℃ 下共同作用一段時(shí)間 ， 中止反應(yīng)后 ， 用SDS聚丙烯酸胺凝膠電泳 ， 用放射照相術(shù)觀察凝膠上碘標(biāo)蛋白的裂解圖像 ， 然后將凝膠切成小條測(cè)其放射性 。 紅細(xì)胞 CR1水平用中位熒光頻道 （ MFCN） 表示 。l將紅細(xì)胞重新混懸及固定 。l冰浴30分種 ， 洗二遍 。 再用 2ml的 ， 加熒光素異硫氰酸鹽 （ FITC） 標(biāo)記的兔抗鼠免疫球蛋白 （ F234） 30181。l加鼠抗人單克隆抗體 50181。 ? （ 7 ） 流 式 細(xì) 胞 儀 測(cè) 定 法（ Folwcytometric assay， FCA） ：待測(cè)紅細(xì)胞用 1%小牛血清磷酸鹽緩沖液（ PBC ． FCS ） 洗三遍 ， 然后再配成． 108／ ml的懸液 。l反應(yīng)產(chǎn)物臵另一板的相應(yīng)孔中 ， 在 405um測(cè)吸光度 。l加入各孔 ， 22℃孵育 60分鐘 ， 再洗三次 ． 最后將 200181。 然后取 100181。 ? 再加 1％ 小牛血清 250181。 棄去戊二醛 ， 加 200181。 再加 ％ 的戊二醛 PBS溶液 100181。 待測(cè)紅細(xì)胞用 PBS洗過(guò)三遍配成懸液 ，取 100181。 ? （ 6） 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) （ Empme－Linked Immunosorbent Assay， ELISA） ：取 100181。 未凝集的紅細(xì)胞則象淚滴一樣地流出來(lái) ， 而凝集的紅細(xì)胞則粘附在孔底 ， 結(jié)果以能引起凝集的抗 CR1抗體的最高稀釋度表示 。 該法特異性強(qiáng) 。 或?qū)⒓t細(xì)胞溶解后取二個(gè)稀釋度的提取物加入包被 C3b的塑料板孔內(nèi) 。 用 125碘標(biāo)記單抗加待測(cè)紅細(xì)胞 37℃ 作用 30分鐘 ， 取 50181。 ? 放射碘標(biāo)記二聚體 C3b法：將一定濃度的紅細(xì)胞與 125碘標(biāo)記的二聚體 C3b單獨(dú)或加 C3b受體 F（ ab`） 2，0℃ 共育 20分鐘 ， 再用上述微量沉淀法分離開結(jié)合與未結(jié)合的配體 ， 未加抗體管的結(jié)合量減去加人抗 C3b受體 F（ ab`） 2管的結(jié)合量 ， 則為特異結(jié)合量 ， 再按scatchard法計(jì)算出紅細(xì)胞結(jié)合 C3b的量 。 ? 放射碘標(biāo)記 F（ ab`） 2法：靜脈抗凝血紅細(xì)胞 0℃ 下洗過(guò)配成一定濃度 ， 加人 125碘標(biāo)記的非免疫 F（ ab`） 2或 125碘標(biāo)記的抗 C3b受體 F（ ab`） 2， 20℃ 作用 60分鐘 ，各取 丁酯的微量離心管中 ， 8000g離心 30秒 ，切斷離心管 ， 管中沉淀和上清液分別含結(jié)合與未結(jié)合的抗體 。 ? （ 4） 放射免疫測(cè)定法 （ Radiohomunoassay，RIA：根據(jù)放射性同位素標(biāo)記部位不同有幾種方法 。 ? 在微培養(yǎng)載片的凹孔中加滿指示細(xì)胞 ，蓋上覆有紅細(xì)胞切片的蓋片 ， 使切片正好位凹孔中央 ， 顛倒載片使指示細(xì)胞下沉到紅細(xì)胞切片上 ， 室溫臵 30分鐘再倒回來(lái) ， 使未結(jié)合的指示細(xì)胞離開玻片 。m厚的切片 ， 臵蓋玻片上 。 以發(fā)生血凝的 AHG的最高稀釋度的倒數(shù)為 IAHA的效價(jià) ， 表示 C3b受體的活性 ， 此法敏感性與特異性均高 。l加入各孔 ， 臵 24℃下 60分鐘后觀察結(jié)果 。l， 再加等量補(bǔ)體 ，37℃ 作用 45分鐘 ， 加入二硫基蘇糖醇溶液固定 。 在 U型微滴定板上將 AHG系列倍比稀釋 （ 原始濃度100181。 用時(shí)溶于磷酸緩沖液 ， 65℃ 加熱 30分鐘 ， 冰水冷卻 ， 15000g離心 15分鐘 。 ? （ 2 ） 免疫粘 附血凝試 驗(yàn) （ immune adherence haemagglutination IAHA） ：用人混合血清經(jīng)鹽析和二乙胺乙基纖維素層析得到人 IgG。m， 而羊紅細(xì)胞只有 4－ 5181。 ? 混合后即取一滴臵載玻片上 ， 上加蓋片 ，室溫 （ 20— 23℃ ） 作用 20分鐘 ， 相差顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù) 100個(gè)人紅細(xì)胞 ， 以粘附至少一個(gè)羊紅細(xì)胞為陽(yáng)性 ， 算出百分率 。 所有細(xì)胞均用改良 Hanks液洗三遍配成所需濃度 。 現(xiàn)將國(guó)外有關(guān)紅細(xì)胞 CR1研究的幾種實(shí)驗(yàn)方法介紹如下： ? （ l） 紅細(xì)胞 紅細(xì)胞花環(huán)試驗(yàn) (Red Cell－ Red Cell Rosette):即 Siegel首次提出的標(biāo)準(zhǔn) RICA試驗(yàn) 。 國(guó)外有關(guān)紅細(xì)胞 CR1研究 的幾種測(cè)定方法 ? 紅細(xì)胞的免疫粘附作用是通過(guò)細(xì)胞膜上的 I型補(bǔ)體受體 （ CR1；或 C3b受體 ） 來(lái)實(shí)現(xiàn)的 。 ? 2． 溶解后未用的試劑 ， 被調(diào)節(jié)細(xì)胞臵4℃ 冰箱四天內(nèi)效價(jià)不變 ， 高效價(jià)補(bǔ)體致敏酵母試劑臵冰盒內(nèi)一周內(nèi)效價(jià)不變 。 ? 從上表可以看出 ， 惡性腫瘤 、 乙肝患者和創(chuàng)傷 （ 骨折 ） 患者紅細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能與健康人比較 ， 其促進(jìn)率明顯下降（ p ） ， 抑 制 率 明 顯 升 高（ p） ， 急性腎炎患者促進(jìn)率升高而抑制率下降 （ P＜ ） ， 與國(guó)內(nèi)外報(bào)道基本一致 ， 說(shuō)明用粒細(xì)胞作被調(diào)節(jié)細(xì)胞來(lái)檢測(cè)血清中的調(diào)節(jié)因子對(duì)紅細(xì)胞上CR；的調(diào)節(jié)作用是完全可行的 。 * * 177。 * * 177。 * 177。 * * 177。m 紫紅色 底色干凈，清晰易辨別 高 加細(xì)胞膜穩(wěn)定劑在4℃ 可保存 5天，經(jīng)冷凍干燥活性可保存一年以上 ? 四 ． 臨床應(yīng)用 ? 采用上述試劑和實(shí)驗(yàn)方法 ， 對(duì) 60例健康人 、 30例乙肝患者 （ HBsAg、 HBeAg和抗 — HBc陽(yáng)性患者 ） 、 30例惡性腫瘤（ 肺癌 9例 、 胃癌 14例 、 肝癌 7例 ） 、 17例骨折患者 、 11例急性腎炎 ， 共 148例患者的血清標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè) ， 其結(jié)果如下表： 表 24不同人群 CR1免疫調(diào)節(jié)團(tuán)子檢測(cè)結(jié)果（ X士 S）％ *與對(duì)照組相比 ， P＜ ； **與對(duì)照組相比 ， P＜ n 促進(jìn)率 抑制率 乙肝患者 惡性腫瘤 創(chuàng)傷（骨折）組 急性腎炎 健康獻(xiàn)血員 30 30 17 11 60 177。 58℃ 滅活管花環(huán)率 — 鹽水對(duì)照管花環(huán)率 對(duì)照管花環(huán)率 促進(jìn)率 = 100% 58℃ 滅活管花環(huán)率 — 未滅活管花環(huán)率 58℃ 滅活管花環(huán)率 抑制率 = 100% 表 22 操作程序 滅活管 末滅活管 對(duì)照組 58℃ 滅活血清（ ml） 未滅活血清（ ml） 生理鹽水（ ml） 被調(diào)節(jié)細(xì)胞（ ml） / / / / / / 混勻， 37℃ 30min孵育，洗 2次 補(bǔ)體致酵母菌（ ml） 混勻， 37℃ 30min孵育，加 %戊二醛 1滴，水平抹片，自然干燥，瑞氏染色，高倍鏡，求陽(yáng)性率 三．被調(diào)節(jié)細(xì)胞的比較 表 23 被調(diào)節(jié)細(xì)胞的比較 O型 RBC 粒細(xì)胞 大小 瑞氏染色 鏡下觀察 敏感度 保存方法、時(shí)間 69181。l 混勻 ，37℃ 30min孵育 ， 取出后用含 1 ％ 小牛血清HBSS— H洗 2次 ， 棄去上清液 ， 再加高效價(jià)補(bǔ)體致敏酵母菌懸液 10181。 （ 2） 補(bǔ)體致敏 （ 高效價(jià) ） Ys酵母茵懸液制備：取凍干高效價(jià)補(bǔ)體致敏 Ys酵母試劑 1支 ， 用生理鹽水洗 2次 ， 恢復(fù)體積 ， 使其濃度為 6X 107／ ml懸液備用 。 ? 一 ． 材料 ? HBSS— H（ 無(wú)酚紅 Hank`s平衡鹽溶液 ） ；小牛血清；生理鹽水；凍干被調(diào)節(jié)細(xì)胞及凍干高效價(jià)補(bǔ)體致敏 Ys酵母試劑 （ 陜西省人民醫(yī)院免疫研究室生產(chǎn) ） ；生物顯微鏡；小型離心機(jī)；普通冰箱等 。 ? 同時(shí)在比較三種細(xì)胞的基礎(chǔ)上 ， 選擇能長(zhǎng)期保存 、 體積較大 、 敏感性高的粒細(xì)胞作為血清中 CRI免疫調(diào)節(jié)因子測(cè)定實(shí)驗(yàn)用的被調(diào)節(jié)細(xì)胞 ， 并以高效價(jià)補(bǔ)體致敏的酵母菌作靶細(xì)胞 。 1988年 ， 郭峰發(fā)現(xiàn)血清中還存在紅細(xì)胞免疫粘附促進(jìn)因子 。 ? 4． 意義 ? 為紅細(xì)胞免疫自身調(diào)控機(jī)理研究提供簡(jiǎn)便有效的手段；對(duì)藥物作用免疫學(xué)機(jī)理和疾病發(fā)病機(jī)理研究以及對(duì)機(jī)體紅細(xì)胞免疫功能變化分析都有其重要價(jià)值 。 另外對(duì)血清滅活溫度的控制 （ 保持 58℃ ） ， 作用時(shí)間 （ 固定半小時(shí) ） 很重要 。 該法在郭峰原法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改良 ， 建立了 RFERR與 RFIR一步測(cè)定法 ， 有利于推廣應(yīng)用 。 ? 37℃ ， 使實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定 ， 不易受室溫變化的影響 ， 結(jié)果可靠 ?？梢?jiàn) ， 測(cè)定患者血清中 RFER與 RFIR的比值在臨床上有著重要意義 。 上表中 RFER／ RFIR的比值明顯減少 （ 正常對(duì)照為 177。 ? 血清中紅細(xì)免疫促進(jìn)因子與紅細(xì)胞免疫抑制因子在血清中的含量 ， 可用其 RFER與 RFIR的比值來(lái)表示 ， 值的大小可反映血清中調(diào)節(jié)因子的變化規(guī)律 ， 同時(shí)亦能間接反映紅細(xì)胞的免疫功能 。 ） ， RFIR明顯上升 （ 對(duì)照組 177。 ＞ ＞ ＞ ? 從上表可以看出 ， （ 1） 用一步法對(duì) 52例惡性腫瘤患者紅細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)因子的檢測(cè)結(jié)果與兩步法 （ 原方法 ） 檢測(cè)結(jié)果基本相一致 ， 二者無(wú)顯著性差異 （ P＞ 0． 05） ， 說(shuō)明將血清 、 O型 RBC和補(bǔ)體致敏 Ys酵母菌三者依次加人進(jìn)行一次孵育與三者分別加入進(jìn)行兩次孵育所得