【正文】 7. 進行病毒侵染前后靶基因相關(guān) siRNA northern blot、測序檢測；靶基因 DNA甲基化測序、 Southern blot 檢測和信息學(xué)分析；和上述在目標(biāo)突變體的研究結(jié)果相比較，研究突變體和病毒侵染對靶基因甲基化改變的相關(guān)性 ； 根據(jù)第 13 年的研究結(jié)果進一步研究RNA 干擾的作用機理及其在抗病毒中的作用 ； 利用過表達人工 miRNA 等轉(zhuǎn)基因方法對 23 個水稻小 RNA 介導(dǎo)的抗病反應(yīng)進行驗證 。 5. 從蛋白生化反面分析 Pigm與 OsSGT1，BBI1， OsRAR1， OsNPR1 是否存在互作，結(jié)合遺傳的數(shù)據(jù)，建立 Pigm 的基礎(chǔ)抗病防衛(wèi)反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)。 4. 利用酵母雙雜及免疫共沉淀技術(shù)，尋找其他參與 R 蛋白下游傳導(dǎo)的蛋白 及其他參與 SAR 下游傳導(dǎo)的蛋白 ； 深入解析 MEKK1 結(jié)合蛋白、 FLS2 介導(dǎo)的磷酸化蛋白的功能。 2. Xoo 鞭毛蛋白 /解毒蛋白作用及機制分析 ； 效應(yīng)蛋白靶蛋白的功能分析 ；抗病蛋白互作蛋白的功能鑒定及分子生物學(xué)研究 ； 抗病基因和無毒基因互作的分子機制研究。 15. 申請專利 1012 項。 13. 篩選 5 萬個 F2 個體，獲得 Pigm 和Pi9 重組的 F2 單株 23 株；獲得Pigm9 位點純合的單株 23 個。 11. 分析 OsNPR1 介導(dǎo)的 SA 與生長素途徑之間的 crosstalk 及關(guān)鍵因子功能 ； 發(fā)表關(guān)于 ROD 基因研究工作的論文 ； 發(fā)表水稻抗白葉枯病基因（ QTL）功能相關(guān)的論文 ； 克隆 2 個新的廣譜抗病基因（ QTL） ； 克隆至少一個 Pigm/ROD的 supprosser 突變基因 ； 克隆一個新的抗銹病 QTL。 9. 對乙烯途徑與水稻抗稻 瘟病反應(yīng)中的關(guān)鍵基因進行功能分析。 7. 找出參與抗病毒的 水稻 關(guān)鍵的 RNA干擾途徑的主要組份 ； 明確候選小RNA 的靶標(biāo)基因，及 Xoo 誘導(dǎo)的水稻小 RNA 是否依賴 RNA 沉默途徑。 11. 利用基因標(biāo)記，繼續(xù)小麥 Yr Yr18 和 Yr36 基因的回交轉(zhuǎn)育。 利用突變、剪切或重組等手段獲得的新型 PIDYr Yr18 或 Yr36 基因，構(gòu)建各自的自然表達 載體并轉(zhuǎn)化到 水稻品種明恢系列或小麥品種濟麥等系列 ； 水稻Pigm9 新位點的 功能評價。 利用攜帶新型等位基因（ PID Yr Yr18 和Yr36 等 ）的轉(zhuǎn)基因植株，確定轉(zhuǎn)基因在受體基因組的整合和表達模式 ； 小麥 EDR1 和 EDR2 同源基因 的功能驗證。 7. 利用 RNAi和過表達方法對 SA 與生長素途徑之間具有重要作用的基因進行分析，闡明其遺傳學(xué)功能。 6. 明確 35 個在宿主作物 禾谷鐮孢互作中起作用的重要基因 ； 初步揭示活性EPS 寡聚體對宿主植物抵抗病源菌入侵的作用 ； 明確靶基因?qū)Σ《厩秩镜膽?yīng)答效應(yīng)，及其參與的抗性途徑機制 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 鐮孢應(yīng)答基因在植病互作中起重要作用 ； 用不同的 EPS 寡聚體處理宿主植物，接種病源菌，觀察其侵染能力的變化。 4. 確定 12 個 SAR 突 變體的突變位點 ；解析連接 MEKK1 與 PRR 受體 FLS2 的蛋白組份。 2. 克隆 12 個新的 bir1, snc1, snc2, 等的抑制子基因。分析 LPS 結(jié)合蛋白和 LPS 受體在病原識別和植株發(fā)育過程中的功能。 水稻MAPK 突變體， RNAi 植株純合及抗病分析。 2. Xoo 鞭毛蛋白 /解毒蛋白的糖基化分析及表型分析 ； 效應(yīng)蛋白靶蛋白的分離鑒定 ； 抗病蛋白互作蛋白的篩選 ；抗病基因和無毒基因互作的分子機制研究。 15. 申請專利 78 個。 13. 篩選 5 萬個 F2 個體，獲得 Pigm 和Pi9 重組的 F2 單株 23 株。 11. 通過突變、剪切或重組，創(chuàng)建 PIDYr Yr18 或 Yr36 基因 的新型設(shè)計抗病基因 ； 水稻 Pigm 與 Pi9 基因重組位點的創(chuàng)建 ； 繼續(xù)水稻 xa Xa2Pid2 和 Pid3 基因的回交轉(zhuǎn)育 ； 利用基因標(biāo)記，繼續(xù)小麥 Yr Yr18 和Yr36 基因的回交轉(zhuǎn)育。 對上年度獲得的新型抗病等位基因（ PID Yr Yr18 和 Yr36 等 ），構(gòu)建 自然表達 載體并轉(zhuǎn)化到 水稻或小麥 中； 小麥 EDR1 和 EDR2 同源基因 的功能驗證。 12. 創(chuàng)建 PID Yr Yr18 或 Yr36 基因 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 具有 crosstalk 功能的候選基因。 9. 篩選并獲得水稻 OsNPR1 基因調(diào)控的信號途徑下游成分并對其進行遺傳分析。 7. 分析乙烯反應(yīng)被阻斷后對水稻抗病性的影響及相關(guān)表型變化。 5. 明確病毒 參與抗性 TGS 目標(biāo)蛋白 靶基因 DNA 甲基化的作用三者互作關(guān)系和調(diào)控模式 ； 得到一整套針對水稻RNA干擾途徑主要基因的穩(wěn)定的 RNAi突變體株系。 3. 初步定位 12 個 SAR 突變體 ； 解析MEKK1 結(jié)合蛋白 ； 初步建立鑒定 Pigm的抗病防衛(wèi)反應(yīng)基礎(chǔ)信號網(wǎng)絡(luò)體系。 再克隆病原菌效應(yīng)蛋白基因 12個，并認(rèn)識病原效應(yīng)蛋白基因的功能，分離其植物體內(nèi)的靶標(biāo)基因 35 個；鑒定抗病蛋白復(fù)合體組份 23 個，明確植物 NBLRR類抗病蛋白分子間的相互作用及對其功能的影響；找到bir1, snc1, snc2, snc4， mkk1 mkk2 的抑制子基因 34 個。 鑒定及獲得組成性乙烯反應(yīng)的水稻材料株系；分析在組成性乙烯發(fā)育水稻株系中，具有抗性或是具有感病性水稻對病 原 菌侵染的反應(yīng)及病斑程度 。 7. 利用生物 信息學(xué)方法對 Xoo侵染水稻獲得的小 RNA 進行分類 ， 預(yù)測小 RNA的靶基因 ； mRNA 表達譜分析。 5. 采用激光顯微切割，基因組芯片等，揭示宿主作物細(xì)胞在禾谷鐮孢侵染早期的動態(tài)轉(zhuǎn)錄組；分析其免疫應(yīng)答與作物細(xì)胞本身能量、物質(zhì)代謝途徑交叉互作的結(jié)點 /關(guān)鍵分子 ； 通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法篩選活性 EPS 寡聚體誘導(dǎo)表達的宿主植物基因。 3. 利用圖位克隆和高通量測序技術(shù)鑒定bir1, snc1, snc2, snc4， mkk1 mkk2 的抑制子所在的突變位點 ； 對 SAR 突變體進行表型分型及初定位 ； 進行 MEKK1免疫共沉淀 。 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 二 年 1. PTI 通路新基因的克隆、鑒定 ； PRR 受體蛋白互作蛋白篩選。 14. 發(fā)表 SCI 文章 10 篇左右。 12. 構(gòu)建 xa5Xa21Pid2Pid3 聚合載體和Yr10Yr18Yr36 聚合載體各 1 個 。 Yr18 和 Yr36 新型等位基因 35 個。 8. 獲得乙烯耐受水稻株系，對多種致病稻瘟病菌進行感病分析；利用 MCP處理，分析抗性水稻在喪失乙烯反應(yīng)后對相應(yīng)的稻瘟病菌發(fā)生的抗性變化 ； 將乙烯耐受基因?qū)肟剐缘乃酒贩N；將造成組成性乙烯反應(yīng)將有轉(zhuǎn)入感病水稻品種以及抗病水稻品種中，獲得相關(guān)的組成 性乙烯反應(yīng)水稻材料 ； 分析過表達 OsNPR1 基因不同株系的抗病性及其它與生長發(fā)育有關(guān)的表型。 7. Xoo誘導(dǎo) 水稻小 RNA 的 Solexa 測序建立 miRNA 與 siRNA 表達譜 。 9. 精細(xì)定位抗銹病 QTL；克隆 2 個抗黃萎病相關(guān)基因。 7. 分析乙烯對水稻抗 抗病性 的作用，構(gòu)建相應(yīng)的水稻研究株系。 5. 明確擬南芥中參與抗病的表觀遺傳途徑相關(guān)蛋白； 明確 Xoo 誘導(dǎo) 或 抑制 水稻表達的特異小 RNA 和 mRNA； 獲得針對 RDR2， DCL3， DCL1， DCL4， AGO1和 AGO4 等 的 RNAi 突變體株系。 3. 篩選到 5 個組成型抗病突變體的相關(guān)抑制子；建立 SAR 篩選體系；完成對SARD1 及 SARD2 的生化功能分析；篩到多個 spi 感病突變單株。 6. 建立病毒侵染水稻的研究體系 ， 構(gòu)建針對水稻 RNA 干擾途徑主要基因的轉(zhuǎn)基因 RNAi 突變體株系 ， 包 括1. 分離鑒定 PTI 途徑基因 12 個；分離鑒定 ETI 途徑基因 12 個；克隆病原菌效應(yīng)蛋白基因 12 個； 得到與MEKK1 結(jié)合的候選蛋白； 鑒定抗病蛋白下游 組份 12 個；明確植物抗病蛋白結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。建立分離 LPS 結(jié)合蛋白的生物化學(xué)標(biāo)記體系。 3. 對 bir1,snc1,snc2,snc4， mkk1 mkk2 這5 個組成型抗病的突變體做抑制子篩選 ； 對抑制子進行表型分析及初定位 ；建立 SAR 篩選體系，分析 SARD1 及SARD2 的生化功能 ； 擬南芥 MEKK1 結(jié)合蛋白酵母雙雜交篩選。 四、年度計劃 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 一 年 1. 擬南芥 PTI 相關(guān)突變體的篩選； PRR受體蛋白酵母雙雜交庫的構(gòu)建 ； 抗病蛋白系列置換突變體構(gòu)建與功能分析 ；水稻抗病蛋白與病原菌效應(yīng)蛋白基因的 克隆。 此外，項目組大部分骨 干都曾在國際上著名的實驗室中從事植物分子生物學(xué)和植物病理學(xué)工作多年，在國內(nèi)建立了優(yōu)秀的實驗室，并和國際權(quán)威人士建立了良好的交流與合作關(guān)系。 Microbes, PLoS Pathogens， Journal of Virology, Plant Journal, Plant Physiology, Molecular MicrobePlant Interaction 等。本項目組織的骨干隊伍集中了國內(nèi)優(yōu)勢的研究單位，研究方向全面、合理，分別涉及到農(nóng)作物抗病、真菌病害、細(xì)菌病害、病毒病害等本領(lǐng)域重點分支，在多個研究領(lǐng)域如水稻功能基因組學(xué)、植物免疫、作物抗病性、病原菌基因組學(xué)、表觀遺傳等方面做出了一系列突破性的研究成果。在植物免疫途徑（ PTI， ETI）及其互作、植物免疫的表觀遺傳調(diào)控、 SAR調(diào)控、作物廣譜抗病基因的功能機制及其育種應(yīng)用、水稻抗紋枯病等方面可望有重大的突破性成果。一些前期研究已經(jīng)處于穩(wěn)步開展階段，多個作物主要抗病基因和擬南芥免疫關(guān)鍵調(diào)控基因已經(jīng)克隆，植物表觀遺傳機制已有重大新發(fā)現(xiàn)，為本項目的順利實施提供了有力保障。 4. 研究基礎(chǔ)較好 。其它相關(guān)的平臺 , 如表觀遺傳、蛋白組學(xué)、表達組學(xué)、生物信息學(xué)、植物病理學(xué)、生物化學(xué)、蛋白質(zhì)相互作用、細(xì)胞生物學(xué)等現(xiàn)代生物學(xué)研究手段均已建立并不斷改進。 3. 技術(shù)路線成熟。 我國主要農(nóng)作物栽培歷史長，栽培區(qū) 域差異大，抗病性資源豐富，并具有較高的抗病育種水平。 1. 項目有廣泛共識 ：本項目已經(jīng)經(jīng)過 3 年多的籌備，尤其通過 2020 年 5 月第 349 次 香山科學(xué)會議 《植物先天免疫機制》、 2020 年 2 月第 9 次中國科學(xué)院 上海交叉學(xué)科論壇 《植物免疫與作物生產(chǎn)》，與會專家與項目組骨干進行了廣泛的討論，根據(jù)學(xué)科的發(fā)展與國家農(nóng)業(yè)的重大需求，凝練了關(guān)鍵的科學(xué)問題與重點研究方向，研究思路明確，目標(biāo)集成可行性強。 依托本項目的實施，將 進一步凝練我國在植物免疫和作物抗病分子領(lǐng)域的戰(zhàn)略目標(biāo)， 培養(yǎng)一批在專業(yè)領(lǐng)域具有高國際顯示度的中青年學(xué)科帶頭人， 建設(shè)具有國際一流水平的 創(chuàng)新 研究團隊。從而為推動抗病新策略、新技術(shù)的發(fā)展提供直接的指導(dǎo)。 本項目除了要在植物免疫學(xué)科領(lǐng)域上創(chuàng)立我國的高水平前沿研究優(yōu)勢，取得系統(tǒng)性的研究成果，同時也要在作物廣譜持久抗性尤其是數(shù)量性狀（ QTL）抗性的分子機制、腐生菌（如紋枯病）的抗病基因資源、作物抗病育種的分子設(shè)計理論與實踐等方面 建立國際領(lǐng)先的研究體 系與技術(shù)平臺 。尤其將開展水稻抗瘟性復(fù)等位基因的簇內(nèi)重組，創(chuàng)造新的廣譜抗病基因位點， 在抗病遺傳理論與育種實踐上都是一個有重大創(chuàng)新意義的課題。 5. 新的技術(shù)路線集成 。 為實現(xiàn)項目 目標(biāo)，本項目將廣泛收集和創(chuàng)制新型 的研究材料，如作物廣譜抗病和 QTL 遺傳資源、抗腐生病害遺傳資源、抗病基因抑制（ suppressor）突變體。 本項目對植物免疫的表觀遺傳機制的創(chuàng)新研究，將為農(nóng)作物抗病 從 理論和應(yīng)用實踐上 開辟 新的研究體系 。表觀遺傳機制應(yīng)答生物脅迫和作物的抗病沉默機制的研究的報導(dǎo)寥寥無幾。國際 上，包括 RdDM 途徑的表觀遺傳學(xué)研究主要集中在植物自身的開花發(fā)育調(diào)控和非生物脅迫應(yīng)答。本項目密切結(jié)合學(xué)科發(fā)展動向，前瞻性地部署前沿研究領(lǐng)域，重點包括植物基礎(chǔ)免疫與?；悦庖叩慕换プ饔茫?crosstalk）、表觀遺傳機制對于植物免疫的調(diào)控功能和新的抗病性研究策略、作物廣譜持久抗病性的機制等。 3. 新的前瞻性研究部署 。 本項目緊密結(jié)合學(xué)科創(chuàng)新和國家重大需求， 以我國重要農(nóng)作物病害抗性為研究重點，借鑒以擬南芥為主要模式的研究方法與研究成果， 提出了 4 個關(guān)鍵科學(xué)問題，重點研究作物廣譜持久抗性的分子基礎(chǔ)；植物抗病性的表觀遺傳學(xué)機制；抗病性與產(chǎn)量性狀的關(guān)系，及抗病育種分子設(shè)計新思路。以作物對重要活體寄生（ biotroph）與腐生（ necrotroph）病害的免疫應(yīng)答及其互作為主線，強調(diào)頂層 設(shè)計與整合；建立 以我國主糧作