【正文】 ③ 脂肪酶在造紙工業(yè)上的應(yīng)用 自 90 年代初脂肪酶已被應(yīng)用到一個(gè)大型造紙過程中，作為日常運(yùn)作；脂肪酶用于廢紙脫墨可以提高制漿效率，增加紙張白度和強(qiáng)度，減少化學(xué)品的使用，延長設(shè)備壽命， 減少廢水的污染程度，節(jié)約能源，節(jié)省時(shí)間，降低綜合成本等。 ② 脂肪酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用 通常情況下，芳香和香味成分是由化學(xué)合成或從天然來源中提取的，從植物中提取芳香物質(zhì)的量有限，無法滿足人們的需求，而脂肪酶可以用來催化合成不同的芳香酯。但幼禽幼畜消化技能尚未發(fā)育健全，內(nèi)源性消化酶分泌量不足。 ① 脂肪酶在 飼料工業(yè)上 的應(yīng)用 脂肪酶 是脂肪代謝最基本的酶，若缺乏將會(huì)危機(jī)機(jī)體健康。同時(shí)，建立嚴(yán)格保密機(jī)度和法律保護(hù)制度，對公司機(jī)密文件或圖紙等一律以原件存檔，實(shí)行借閱登記與定期歸還；涉及核心技術(shù)簽定技術(shù)保密協(xié)議，對技術(shù)泄密者一律采取法律制裁，從多方面確保項(xiàng)目不發(fā)生因人的離任而無法實(shí)施的狀況?；诖耍夜疽阎朴喠讼鄳?yīng)的人力資源規(guī)劃，以人為本，建立健全的激勵(lì)機(jī)制，如成果獎(jiǎng)勵(lì)、技術(shù)入股、 股份期權(quán)、成果命名、提供住房、解決家人就業(yè)，提供出國培訓(xùn)和出國旅游、待遇傾斜等制度，以最大限度留住人才。我們首先從原材料抓起：原料進(jìn)廠后先進(jìn)行成分分析，按照經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)論證制定工藝，在生產(chǎn)過程中，我們嚴(yán)格按照生產(chǎn)工藝流程規(guī)范，嚴(yán)把各個(gè)工序質(zhì)量關(guān)，提高成品 質(zhì)量和 合格率。 同時(shí)基 于其高標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品特性，對生產(chǎn)原料、制備工藝、技術(shù)參數(shù)和生產(chǎn)設(shè)備等要求極其苛刻。 項(xiàng)目實(shí)施風(fēng)險(xiǎn)及應(yīng)對措施 創(chuàng)新基金項(xiàng)目申報(bào)書第 53頁科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新基金項(xiàng)目申報(bào)書無償資助類（ □初創(chuàng)期企業(yè) █成長期企業(yè)）項(xiàng)目名稱： 利用酵母展示技術(shù)制備新型脂肪酶 技術(shù)領(lǐng)域： 輕化工生物技術(shù) 企業(yè)名稱（蓋章）： 湖北曬買劣胺撲漆慶燥冒召議探祖捧相糊翰壇刮罩離箱臆瑞熬盧甄丑漂疫轉(zhuǎn)餾鋼瑯沖洽鼓閥座諒封油 腑毖仇嫂裙平覺慕復(fù)位退又疲又萄媒更帥碰級承傈 技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)及對策 酵母展示脂肪酶發(fā)酵生產(chǎn)及研發(fā)應(yīng)用項(xiàng)目的產(chǎn)業(yè)化與中試成果有相當(dāng)大的一段距離，不是對中試的簡單照搬和放大，存在較大的技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)，為此，我公司投重資建立一條小規(guī)模的生產(chǎn)線， 利用國內(nèi)線先進(jìn)成果和技術(shù)，對工藝技術(shù)和設(shè)備進(jìn)行優(yōu)化，不斷摸索合適的工藝指標(biāo)參數(shù)，小批量生產(chǎn)產(chǎn)品，產(chǎn)品不斷進(jìn)行應(yīng)用試驗(yàn)，對工藝技術(shù)和生產(chǎn)設(shè)備進(jìn)行驗(yàn)證。展示脂肪酶應(yīng)用于 乙酸香葉酯和丁酸香葉酯 的合成過程優(yōu)化，轉(zhuǎn)化率均達(dá) 95%以上 。 產(chǎn)品檢測情況 送樣廣州工業(yè)微生物檢測中心檢查合格 。 待研究的關(guān)鍵技術(shù)： 各個(gè)工藝單元技術(shù)參數(shù)的進(jìn)一步優(yōu)化，制定和完善規(guī)?；a(chǎn)工藝。 ③將細(xì)胞表面展示南極假絲酵母脂肪酶 B(PPSCALB)的重組畢赤酵母用于非水相中催化合成數(shù) 10 種短 鏈芳香酯，優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件，提高轉(zhuǎn)化效率。 關(guān)鍵技術(shù)采用、攻克及待研究的情況 項(xiàng)目 關(guān)鍵技術(shù)： ①構(gòu)建畢氏酵母展示體系應(yīng)用于脂肪酶 RML 和 CALB 得展示表達(dá)，制備高活性展示（固定化）脂肪酶。展示脂肪酶應(yīng)用于 乙酸香葉酯和丁酸香葉酯 的合成過程優(yōu)化，轉(zhuǎn)化率均達(dá) 95%以上 。 （ 5）通過本項(xiàng)目實(shí)施，企業(yè)新獲得的相關(guān)證書情況（驗(yàn)收指標(biāo)） 通過本項(xiàng)目實(shí)施，企業(yè)新獲得的相關(guān)證 書情況 質(zhì)量認(rèn)證體系證書 通過 ISO9001－ 2020認(rèn)證及 HACCP食品安全認(rèn)證 國家相關(guān)行業(yè)許可證 獲得產(chǎn)品生產(chǎn)許可證 專利證書 獲得授權(quán)專利 2項(xiàng) 技術(shù)、產(chǎn)品鑒定證書 開發(fā)新產(chǎn)品 2個(gè)；新工藝 2個(gè) 其他 發(fā)表論文 2篇；建 成 年產(chǎn) 150噸 生產(chǎn)線 三、 項(xiàng)目技術(shù)成熟 程度 創(chuàng)新基金項(xiàng)目申報(bào)書第 53頁科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新基金項(xiàng)目申報(bào)書無償資助類（ □初創(chuàng)期企業(yè) █成長期企業(yè)）項(xiàng)目名稱： 利用酵母展示技術(shù)制備新型脂肪酶 技術(shù)領(lǐng)域： 輕化工生物技術(shù) 企業(yè)名稱（蓋章）： 湖北曬買劣胺撲漆慶燥冒召議探祖捧相糊翰 壇刮罩離箱臆瑞熬盧甄丑漂疫轉(zhuǎn)餾鋼瑯沖洽鼓閥座諒封油腑毖仇嫂裙平覺慕復(fù)位退又疲又萄媒更帥碰級承傈 項(xiàng)目技術(shù)成熟性 創(chuàng)新基金項(xiàng)目申報(bào)書第 53頁科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新基金項(xiàng)目申報(bào)書無償資助類（ □初創(chuàng)期企業(yè) █成長期企業(yè)）項(xiàng)目名稱： 利用酵母展示技術(shù)制備新型脂肪酶 技術(shù)領(lǐng)域： 輕化工生物技術(shù) 企業(yè)名稱（蓋章）： 湖北曬買劣胺撲漆慶燥冒召議探祖捧相糊翰壇刮罩離箱臆瑞熬盧甄丑漂疫轉(zhuǎn)餾鋼瑯沖洽鼓閥座諒封油腑毖仇嫂裙平覺慕復(fù)位退又疲又萄媒更帥碰級承傈 項(xiàng)目目前所處階段 中試 現(xiàn)階段本項(xiàng)目直接參與人數(shù) 26人 項(xiàng)目產(chǎn)品銷售 情況 試銷 關(guān)鍵技術(shù)成熟性分析 項(xiàng) 目是攻克了新型脂肪酶產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵技術(shù)， 利用近十年來新發(fā)展起來的酵母展示技術(shù)，借助生物信息學(xué)與基因工程技術(shù)構(gòu)建了一套酶分子改造與酶催化耦聯(lián)化的技術(shù)體系，篩選獲得了 2株具有耐熱與耐有機(jī)溶劑的突變子，并基于畢氏酵母細(xì)胞表面構(gòu)造兩種新型展示脂肪酶 PPSCALB和 PPSRML，完成發(fā)酵優(yōu)化與天然固定化酶的制備工藝優(yōu)化，建立了50公斤 展示脂肪酶的發(fā)酵生產(chǎn)線。 主要技術(shù)指標(biāo)：發(fā)酵 120h PPSCALB 和 PPSRML 的酯化酶活分別達(dá)到 1160 U/g 和465 U/g， PPSCALB 催化短鏈芳香酯， 6h 轉(zhuǎn)化率達(dá)在 95%以上。畢氏展示脂肪酶具有固定化酶的特點(diǎn)，通過高密度細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶工藝和快速干燥技術(shù)制備獲得畢氏酵母展示脂肪酶，大大簡化了生產(chǎn)工藝，節(jié)約了生產(chǎn)成本。利用展示 PPSRML脂肪酶催化煎炸油，反應(yīng) 72h后脂肪酸甲酯產(chǎn)率為 %，最高轉(zhuǎn)化率為進(jìn)口酶的 90%。 ⑥展示脂肪酶 PPSRML可催化大豆油等轉(zhuǎn)酯合成（生物柴油）脂肪酸甲酯。應(yīng)用于 10種以上的短鏈芳香酯的合成，轉(zhuǎn)化效率均達(dá) 95%以上，達(dá)到或超過進(jìn)口酶的合成效率， 合成成本僅為進(jìn)口酯化酶的 35%以下，接近化學(xué)合成法生產(chǎn)短鏈芳香酯的成本，具有天然的香基風(fēng)味。 ④已經(jīng)完成 20批次的 50升發(fā)酵罐的小試生產(chǎn)，并建立 1套 5噸生產(chǎn)規(guī)模的發(fā)酵、提取、低溫干燥生產(chǎn)線，完成 5噸發(fā)酵罐的脂肪酶展示固定催化劑的中試生產(chǎn)。 ③基于發(fā)酵過程多尺度發(fā)酵優(yōu)化技術(shù)和發(fā)酵過程多參數(shù)控制的放大技術(shù)在畢氏酵母展示的脂肪酶發(fā)酵優(yōu)化中，實(shí)現(xiàn)了畢氏酵母的高密度高表達(dá)培養(yǎng)及發(fā)酵水平的大 幅提高。我們的創(chuàng)新在于： ①通過自主構(gòu)建的畢氏酵母細(xì)胞表面展示體 系和脂肪酶的密碼子優(yōu)化等，實(shí)現(xiàn)了脂肪酶在酵母細(xì)胞表面的高效表達(dá)。展示脂肪酶畢赤酵母細(xì)胞發(fā)酵以甘油和甲醇為主要碳源，另外添加一些必需無機(jī)氮源及營養(yǎng)物質(zhì)，采用流加培養(yǎng)工藝生產(chǎn)脂肪酶微生物細(xì)胞，其工藝參數(shù) ：甘油含量 40g/L、硫酸銨 4g/L、 PTM1 4mL/L 和 CaSO410nM；最適生長和產(chǎn)酶的 pH 分別為 和 ，最適生長和產(chǎn)酶溫度為 30℃；甘油流加階段以 (L?h)的流速流加甘油 12h，甲醇誘導(dǎo)階段以(L?h)恒速流加甲醇，流加時(shí)間 130 小時(shí)左右。 生產(chǎn)罐培養(yǎng)： 50T發(fā)酵罐培養(yǎng)，溫度 29177。 種子罐培養(yǎng)工藝條件：接種量 1%左右，溫度 35177。 工藝條件 : 搖瓶種子制備工藝條件：搖床轉(zhuǎn)速 220 轉(zhuǎn) /分鐘，培養(yǎng)溫度 29177。 項(xiàng)目技術(shù)路線： 脂肪酶生產(chǎn)品種包括：新型展示脂肪酶 PPSCALB 和 PPSRML。采取半連續(xù)添加已酸的方法在 50L 體系中試中催化合成已酸乙酯，使產(chǎn)品生產(chǎn)接近化學(xué)合成法的成本。 ②建立了基于酵母展示的酶分子改造與催化耦聯(lián)化的體系，應(yīng)用于耐熱脂肪酶的改造與篩選。 構(gòu)建 的 酶定向進(jìn)化與催化耦聯(lián)化體系 ， 成功地應(yīng)用于脂肪酶分子改造及在催化反應(yīng)體系中的高通量篩選和評價(jià)，獲得在耐熱穩(wěn)定性 PPSCALB(Candida antarctica lipase B)及耐熱穩(wěn)定性PPSRML (Rhizomucor miehei lipase)兩種有效突變子 ， 酯化活力分別達(dá) 1160 U/g和 465 U/g，酶活力接近進(jìn)口脂肪酶，大大降低了生產(chǎn)成本，該用于酶制劑生產(chǎn)成本僅為進(jìn)口酶的 %。本課題組在國內(nèi)較早建立酵母細(xì)胞表面展示體系，利用絮凝素、凝聚素等酵母細(xì)胞壁融合蛋白構(gòu)建畢氏酵母展示體系，畢氏酵母展示脂肪酶分子有效地固定化在畢氏酵母細(xì)胞表面，由于畢氏酵母容易實(shí)現(xiàn)高密度細(xì)胞培養(yǎng)和外源蛋白的大量表達(dá)，大大提高了脂肪酶的產(chǎn)量；此外，由于酵母展示酶培養(yǎng)后直接通過離心、干燥便可制備全細(xì)胞固定化脂肪酶，展示酶還具有使用后易回收及再生的特點(diǎn)，大大降低了固定化酶的制備 成本，在酶制劑的工業(yè)化生產(chǎn)中體現(xiàn)了巨大的優(yōu)勢。 Schreuder等人首先利用酵母細(xì)胞壁蛋白質(zhì)的融合構(gòu)建了酵母展示系統(tǒng)；美國麻省理工大學(xué) Wittrup教授用酵母展示體系表達(dá)和篩選抗體和受體蛋白獲得成功；日本京都大學(xué)的植田充美教授等應(yīng)用酵母展示體系在酶分子篩選、極端微生物選育取得重要進(jìn)展，該體系應(yīng)用于生物轉(zhuǎn)化催化、生物分離與分析，最近結(jié)合隨機(jī)基因庫的設(shè)計(jì)，酵母展示體系應(yīng)用于極端微生物篩選， 已經(jīng)獲得耐有機(jī)溶媒和耐酸酵母，為微生物的人工改造和新的全細(xì)胞催化體系構(gòu)建提供了重要的方法。 近年來，利用細(xì)胞展示技術(shù)將酶蛋白固 定化在細(xì)胞表面，并作為高效全細(xì)胞催化劑的研究開始活躍在非水相有機(jī)合成領(lǐng)域。在全細(xì)胞生物催化劑的發(fā)展中 ,酵母細(xì)胞是一種有用的工具。既無需酶的分離純化 ,又避免了在純化過程中的酶活損失 ,更節(jié)省了大量的設(shè)備投資和運(yùn)行費(fèi)用。如著名酶制劑公司諾維信的 Novo 435 脂酶活性高，適用底物廣，但價(jià)格昂貴，價(jià)格高達(dá) 萬元/kg，因此 ,開發(fā)新型脂肪酶固定化方法 ,尋求新的固定化載體備受關(guān)注。 ② 固定化脂肪酶 利用固定化脂肪酶催化有機(jī)相反應(yīng)具有游離酶不可比擬的優(yōu)勢 :可防止凍干的酶粉發(fā)生聚集 ,從而增大酶與底物的接觸面積、產(chǎn)物更容易純化、有利于酶的回收和連續(xù)化生 產(chǎn)、酶的熱穩(wěn)定性及有機(jī)相耐受性顯著提高，可見固定化脂肪酶在許多方面優(yōu)于游離酶。利用高產(chǎn)菌株通過液體深 層發(fā)酵得到的脂肪酶通常需要進(jìn)一步的純化和制備，得到游離的脂肪酶， 游離脂肪酶催化時(shí)反應(yīng)速度較快 ,不受底物、產(chǎn)物的擴(kuò)散限制 ,產(chǎn)物、副產(chǎn)物分離簡單。 目前國內(nèi)外 脂肪酶技術(shù)研究與開發(fā)主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面。 大量研究表明，脂肪酶由于其來源廣泛、種類繁多、這些酶的催化特性也存在較大差異，加上目前僅有 100 種左右可以利用的商業(yè)脂肪酶制劑 ,但是其中僅有少數(shù)幾種能在工業(yè)中使用。在油水界面上，脂肪酶催化三酰甘油的酯鍵水解，釋放更少酯鍵的甘油酯或甘油及脂肪酸。成果在項(xiàng)目合作開發(fā)時(shí)已完成技術(shù)轉(zhuǎn)讓協(xié)議，成果及知識產(chǎn)權(quán)歸屬已清晰。 項(xiàng)目“酵母展示脂肪酶發(fā)酵生產(chǎn)及應(yīng)用研究”成果通過廣東省科技廳組織的科技成果鑒定，整體技術(shù)水平達(dá)到國際先進(jìn)水平。 （ 2）項(xiàng)目 技術(shù)骨干基本情況 （不超過 5 人） 創(chuàng)新基金項(xiàng)目申報(bào)書第 53頁科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新基金項(xiàng)目申報(bào)書無償資助類（ □初創(chuàng)期企業(yè) █成長期企業(yè)）項(xiàng)目名稱： 利用酵母展示技術(shù)制備新型脂肪酶 技術(shù)領(lǐng)域： 輕化工生物技術(shù) 企業(yè)名稱（蓋章）： 湖北曬買劣胺撲漆慶燥冒召議探祖捧相糊翰壇刮罩離箱臆瑞熬盧甄丑漂疫轉(zhuǎn)餾鋼瑯沖洽鼓閥座諒封油腑毖仇嫂裙平覺慕復(fù)位退又疲又萄媒更帥碰級承傈 姓 名 身份證件號碼 學(xué) 歷 博士 所學(xué)專業(yè) 生物科學(xué)與生物工程 目前與企業(yè)之 間的關(guān)系 合作關(guān)系 畢業(yè)學(xué)校 華南理工大學(xué) 通信地址 湖北省團(tuán)風(fēng)縣金鑼港 自我陳述（經(jīng)歷） 我于 1999畢業(yè)于華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程專業(yè)，博士學(xué)位， 之后任職 公司研發(fā)部經(jīng)理一職， 從事工業(yè)酶制劑研究開發(fā) 20 多年，研究方向?yàn)轱暳厦钢苿┭芯块_發(fā)與產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用， 在酶工程、 飼料加工、動(dòng)物營養(yǎng) 等領(lǐng)域取得 多項(xiàng) 研究成果，在國外 SCI 和國內(nèi)核心刊物上發(fā)表論文 20 多篇。 十幾年來，從事 過 國內(nèi)知名企業(yè)的銷售經(jīng)理、總經(jīng)理、大片區(qū)總經(jīng)理及上市公司市場總監(jiān)， 對于飼料及養(yǎng)殖企業(yè)的市場調(diào)研、營銷模式確定、市場開發(fā)、制度建設(shè)、營銷管理、分公司的基建、生產(chǎn)、采購等全盤營運(yùn)管理具有豐富的經(jīng)驗(yàn)，同時(shí)在集團(tuán)化公司的戰(zhàn)略制定、營銷模式確定等方面也有豐富的實(shí)際操盤經(jīng)驗(yàn)。 公司人員總數(shù)、總資產(chǎn)、凈資產(chǎn)、主營業(yè)務(wù)收入、利潤水平情況變化情況 2020 年度 2020 年度 2020 年 4月 人員總數(shù) (人 ) 18 26 43 總資產(chǎn)（萬元） 凈資產(chǎn)（萬元） 主營業(yè)務(wù)收入（萬元） 利潤（萬元） 第 三 部分 項(xiàng)目技術(shù)與產(chǎn)品實(shí)現(xiàn) 創(chuàng)新基金項(xiàng)目申報(bào)書第 53頁科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新基金項(xiàng)目申報(bào)書無償資助類（ □初創(chuàng)期企業(yè) █成長期企業(yè)）項(xiàng)目名稱： 利用酵母 展 示 技 術(shù) 制 備 新 型 脂 肪 酶 技術(shù)領(lǐng)域： 輕化工生物技術(shù) 企業(yè)名稱（蓋章）： 湖北曬買劣胺撲漆慶燥冒召議探祖捧相糊翰壇刮罩離箱臆瑞熬盧甄丑漂疫轉(zhuǎn)餾鋼瑯沖洽鼓閥座諒封油腑毖仇嫂裙平覺慕復(fù)位退又疲又萄媒更帥碰級承傈 一 、 項(xiàng)目基本情況 創(chuàng)新基金項(xiàng)目申報(bào)書第 53頁科技型 中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新基金項(xiàng)目申報(bào)書無償資助類（ □初創(chuàng)期企業(yè) █成長期企業(yè)）項(xiàng)目名稱： 利用酵母展示技術(shù)制備新型脂肪酶 技術(shù)領(lǐng)域： 輕化工生物技術(shù) 企業(yè)名稱（蓋章）： 湖北曬買劣胺撲漆慶燥冒召議探祖捧相糊翰壇刮罩離箱臆瑞熬盧甄丑漂疫轉(zhuǎn)餾鋼瑯沖洽鼓閥座諒封油腑毖仇嫂裙平覺慕復(fù)位退又疲又萄媒更帥碰級承傈 項(xiàng)目基本信息 創(chuàng)新基金項(xiàng)目申報(bào)書第 53頁科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新基金項(xiàng)目申報(bào)書無償資助類（ □初創(chuàng)期企業(yè) █成長期企業(yè)）項(xiàng)目名稱： 利用酵母展示技術(shù)制備新型脂肪酶 技術(shù)領(lǐng)域： 輕化工生物技術(shù) 企業(yè)名稱（蓋章）： 湖北曬