【正文】 實驗材料與方法 材料 實驗動物：雄性 Wistar 大鼠由白求恩醫(yī)大實驗動物中心提供 主要化學試劑和酶 十二烷基肌氨酸鈉 (Sarcosy1) SIGMA公司 , 美國 對硝基酚 β 纖維二糖苷 (pNPC) SIGMA公司 ,美國 焦碳酸二乙酯 (DRPC) SIGMA 公司 ,美國 RNasim、 Agorose、 dNTPs(dATP,dGTP, dCTP, dTTP)華美公司 。故本實驗以大鼠急性脊髓I/R 損傷為模型，對 ICAM1 和內源性 IL1β在脊髓 I/R 損傷時的表達進行定性和定量的動態(tài)觀察 ,了解它們在 I/R 損傷不同階段的變化規(guī)律和病理生理意義。為早期答細胞因子 ,IL1β可被星形膠質細胞、小膠質細胞、神經元細胞和內皮細胞合成分泌，在炎癥初期，通過發(fā)揮其多種生物學效應如刺激它細胞因子和可溶性損傷介質的合成、誘導 PMN 浸潤、影響膠質細胞的基因表達等影響損傷的發(fā)展并調節(jié)創(chuàng)傷的愈合。有關研究多為體外實驗 [110117]，認為炎性介質 IL1β、 TNFα、 IFNγ等可誘導 ICAM1 表達。正常時血管內皮細胞連續(xù)微量表達 ICAM1,但是表達量的增加 .說明 ICAM1介導 PMN 與內皮細胞的粘附及游出血管的過程 ,是內皮細胞表達的諸多粘附分子中較為重要的一種。 ICAM1 是表達在血管內皮細胞表面的單鏈糖蛋白 , 分子量 90KD,屬免疫球蛋白超家族粘附分子。因此，有必要從分 子水平探討其發(fā)病機制，以期從致病環(huán)節(jié)阻斷及干預其發(fā)病進展，降低可逆性脊髓缺血性神經系統(tǒng)的損害。現(xiàn)已證明 ,SCI 后血脊髓 屏障損害是導致組織繼發(fā)性、中心性、變性壞死的重要病理基礎。臨床研究中常見到 SCI 在解剖上并非完全橫斷 ,傷情并不嚴重 ,減壓后癥狀有所緩解，但以后發(fā)展為 “二次癱瘓 ”。 天然人 ECSOD 的制備極 為有限 ,用基因工程方法大量生產 ECSOD,可廣泛用于其在體內結構、轉錄方面的研究 , 并達到治療目的。另外 ,在兔模型中體內血漿交換與以前研究的天然和 CHO 重組酶形式相似。乳清酸蛋白調控順序指導重組基因在乳腺細胞中高水平地特異性表達 。重組、天然 ECSOD都與伴刀豆球蛋白 A篦麻凝集素、麥芽凝集素 結合 ,表明其為糖蛋白。 ECSODcDNA 在 CHO 細胞中的表達 :含 ECSODcDNA 的表達質粒轉染 CHO 細胞被轉染細胞分泌人 ECSOD 到培養(yǎng)基中。 Marklund 小組通過篩選人胎盤 CDNA 文庫 ,釣取 ECSOD 的 cDNA,在中國倉鼠卵巢細胞 (CHO)和小鼠乳腺細胞中得到成功表達。 重組人超氧化物歧化酶的研制 生理狀態(tài)下 ,ECSOD 是組織中含量最少的 SOD 同功酶 ,因此 ,從動物組織或體液等天然材料中提純 ECSOD 難以滿足大量的研究及臨床需要 ,因此有必要開展重組人 ECSOD的研究。主要的原因是 rhSOD 減輕了局部缺血－再灌流產生的自由基對移植的雙方產生損傷程序。 rhSOD 發(fā)揮作用的原因是在腎移植的局部缺血－再灌流引起損傷的過程中， 起到了抗氧化劑的作用，從而有效地降低移植物的免疫遺傳性，并在周期性消除排異性動脈硬化過程中起 有效的作用。結果表明 rhSOD 在急性和周期性的排異反應中起了有利的作用。Land[171]等在腎移植手術中，為確定 rhSOD 的效果，進行了有安慰劑對照組的隨機雙盲試驗。第Ⅰ組、第Ⅲ組、第Ⅳ組的 TBA 水平沒有明顯的變化。第Ⅲ組的 CPKMB、 HBDH 值則與第Ⅳ組沒有明顯的差別。再灌流后 24h 內在不同時間取動脈血樣，測定磷酸肌酸 MB 同工酶 (CPKMB)、α－羥基乳酸脫氧酶 (HBDH)、磷代巴比妥酸(TBA)的變化。 51 位更換心臟瓣膜的病人分為 4 組。 因此這方面的研究有重要的理論 意義和實用價值。這種缺血－再灌流現(xiàn)象常見于心臟、小腸、肝、腎等器官的保護和移植過程。在缺血情況下，腺嘌呤成分解，產生次黃脫氫酶在一種鈣依賴性蛋白酶的作用下轉化為黃嘌呤氧酶。 試驗和臨床觀察表明，心肌局部缺血后及時再灌流可以減小梗塞的面積降低急性心梗病人的死亡率，但是動物模型的實驗又表明盡管再灌流可以降低局部缺血造成損害程序，但又能誘發(fā)其他的損 害， 產生可逆的局部缺血或使細胞受到危害。另外它的分子量大、半衰期短活性低，限制了在臨床方面的應用。目前臨床上應用較多的仍是從動物中提取的 SOD 。目前對 ECSOD 的研究工作仍較多局限于基礎理論和動物實驗研究。在生理 情況下， ECSOD 的存在對多種器官的功能起到保護作用。這兩種有害過不僅發(fā)生在細胞內，在某些情況下更多地發(fā)生于細胞外。 NO 是介導平滑肌舒張、神經傳遞和炎癥控制的重要細胞間信使。動物實驗表明腦內 ECSOD 水平升高能調節(jié) NO 的活性 [169]， SOD擬似劑能保護腦不受 NMDA 介導的神經毒性損傷 [169]。超氧通過滅活 NO 或對 N 甲基 D 門冬氨酸 ( NMDA) 受體的氧化還原作用也參與這些過程 [167]。 NO 被認為是腦內重要的神經遞質，在長時程增強效應產生過程中很可能是作為逆信使，作用于突觸前膜， 增加遞質釋放，維持長時程增強效應 [165]。這提示肺泡隔具有抑制對外來抗原產生炎癥反應的機制。因此，就象在血管中一樣， ECSOD 位于調節(jié) 氣道 NO 依賴的平滑肌舒張的理想部位。多方面研究已表明 NO 是一種強有力的支氣管擴張劑，它促進氣道平滑舒張，調節(jié)氣道張力 [161]。另外，超氧與NO 作用產生的超氧化亞硝基陰離子啟動脂蛋白的氧化 [160]。在動脈粥樣硬化患者的血管中超氧增高 [158] ，這干擾了 EDRF 依賴的血管擴張 [159]。這表明內源性 EC SOD 分布于調節(jié) NO 介導的血管張力的理想部位。動物實驗表明給高血壓鼠靜脈注射含 ECSOD 肝素結構區(qū)的 SOD 結構的物質，其血壓降至正常。已有研究結果 表明高血壓患者血漿脂質過氧化物增加，紅細胞內的 CuZnSOD 與維生素 E 水平降低，高血壓治療后血漿脂 質過氧化物與紅細胞內 SOD 恢復正常 [155]。免疫細胞化學定位研究表明血管內皮與平滑肌間存在高濃度 ECSOD[154]。 EDRF 對超氧的滅活 作用十分敏感。血管內皮細胞能產生 EDRF。人類氣道的軟骨中已發(fā)現(xiàn)有 ECSOD 的信使 RNA 關節(jié)軟骨中也發(fā)現(xiàn)有 ECSOD 活性 [152]。在炎癥反應中，膠原 [145](尤其是 I 型和Ⅲ型 ) 、軟骨 [146]和其它細胞外基質大分子物質如透明質酸 [147]、α 1 蛋白酶抑制物 [148]、肺泡表面活性物質 [149]等對超氧或超氧化亞硝基陰離子介導的降解及破壞作用非常敏感。動物實驗證明增加 ECSOD 水平可阻止超氧化亞硝基陰離子的產生，預防血管源性水腫 [14 143]，缺乏 ECSOD 使肺對氧毒性損傷更為敏感 [143]； ECSOD 還能抑制臭氧暴露引起的炎癥反應 [144]。 ECSOD 有一特殊結構－肝素結構區(qū)，使它特異地定位于組織的細胞外基質，這對于它在細胞外調節(jié) NO 的功能具有重要意義。近年的研究表明ECSOD 在某些組織中含量并不像最初認為的那樣稀少，例如 ECSOD 是臍帶和子宮中SOD 的主要同工酶 [128]。然而，后繼的研究顯示 ECSOD只占組織 SOD 總活性的 %,因而推測這種酶不是細胞外超氧的有效清除劑。哺乳動 物的 SOD 同工酶有三種 :細胞內 (CuZnSOD[6]( 存在于細胞漿、細胞核和超氧酶體中）、MnSOD[120](存在于線粒體內 )最近日益得到重視的細胞外 ECSODSOD[127]。超氧化物歧化酶 (SOD)催化 O2 生成 H2O2 和 O2 的歧化反應 ,能減少 O2 與 NO 的反應。因此 NO 與 O2 的反應在抗感染時對提高巨噬細胞和中性粒細胞的殺傷能力有重要意義 [133]。研究工作表明 NO 易與超氧 (或超氧陰離子 O2)反應 [4]生成超氧化亞硝基陰離子 (ONOO)[5]。腫瘤壞死因子 α (TNFα )和轉化生長因子 β (TGFβ )減少 ECSOD 表達。成纖維細胞培養(yǎng)研究表明 ECSOD 牟表達受若干細胞因子的調節(jié) [141]。人類各組織中 ECSOD 水平從高到低依次為主動脈、子宮、支氣管、肺、腎、心、腦 [13 13 138]，其中在動脈系統(tǒng)中 ECSOD 是 SOD的 主要形式，占 SOD 總活性的 70%[140]。這種 R213G 突變使肝素結構區(qū)失去了一個帶正電荷的氨基酸，從而輕度降低了 ECSOD 的肝素親和力 [136]，這可能是引起血清 ECSOD 水平升高的原因。健康人群的血清 ECSOD 水平可分為兩組 [12 133]，低血清 ECSOD 組 (%)和高血清 ECSOD(%)。這種糖基化也導致 ECSOD 喪失肝素親和力，但不喪失酶的活性 [13 132]。很可能是肝素結構區(qū)的蛋白水解導致 ECSOD 喪失對細胞外基質及細胞表面肝素的親和力而從組織向血漿遷移。組織的細胞外基質中幾乎 100％的 ECSOD 為 C 類 [12 130] 。導致該酶對肝素親和力的逐步喪失而由 C 類 (高肝素親和力 )變?yōu)?A 類 (無肝素親和力 ),其 中間狀態(tài)是由 A 型和 C 型亞基混合構成的 B 類 ( 中度肝素親和力 )ECSOD。 它們可分為三種類型：對肝素無親 和力 (A 類 )、對肝素中度親和力 (B 類 )和對肝素高親和力(C 類 )[128]。正是 ECSOD 這一獨特特征使 ECSOD 能以高濃度存在于細胞外基質或細胞表面特定的區(qū)域，在這一區(qū)域內有效地清除超氧，控制的穩(wěn)態(tài)濃度。 這一高密度的正電荷氨基酸殘的細胞外質與負電荷物和硫肝素產生靜作用。 它的肝素結合位于亞基的羧基端，是一組帶正電荷的氨基酸殘基 (Arg210LysLysArgArg215)[124]。 亞基間的二硫鍵把兩個亞基的肝素結構聯(lián)系在一起，在介導 ECSOD 對肝素的親和力中起重要作用。在 Asn89 有 一氮原子連接的糖基 [121],按酶的活性分析 ,以該糖基區(qū)分為 ECSOD 與細胞內 SOD[122],且該糖基大大增加了 ECSOD 的溶解性[123]。為 ECSOD 的臨床研究和應用提供了非常有價值的基礎資料。 細胞外超氧化物岐化酶 (ExtracllularSuperoride Dismutase EC SOD)的臨床研究進展 ECSOD 是在八十年代初才在人血清中發(fā)現(xiàn)，因為它首先是在細胞外液中發(fā)現(xiàn)的，因此命名為 (extracellucar SOD)。 上述治療均圍繞在缺血性腦病中進行，但在脊髓方面還未進行這方面探討。 N 乙酰 L半胱氨酸，阿司匹林等藥物具有抗 NF的作用，能從轉錄水平上對粘附分子的表達起抑制作用。調控粘附分子的基因表達近期研究發(fā)現(xiàn)，致炎因子 (如 TNFα等 ) 是通過 ( NF nuclear factor B)來調控粘附分子的基因表達的。但也有人認為，抗 CD18 或 ICAM 單抗不能明顯改善動物神經病變的預后。用單克隆抗體，直接 阻斷粘附分子的作用。因此用抗粘附治療減輕甚至防止再灌注損傷是人們極為關注的問題，其方法可歸為以下３類： 已經知道一些致炎因子 (如 C5a、 TNF)可刺激粘附分子在數量與功能上顯著上調 , 故干擾致炎因子可使粘附分子的表達受抑制 ,進而減少白細胞與內皮細胞的粘附。 抗白細胞 內皮細胞粘附治療進展 由于白細胞 內皮細胞粘附性增強。 85％以上的內皮表面PECAM1 分布于細胞連接部位，用其單抗或重組可溶性 PECAM1 分子處理，可阻斷白細胞穿過內皮層，但不影響白細胞與內皮的緊密粘附，而且可見單抗處理后胞大量粘附在內皮細胞連接部位。 此過程可被 CD11/CD18 抗體及抗 ICAM1抗體對白細胞與內皮細胞的粘附及對白細胞外滲的阻斷作用證實?？?L 選擇素抗體及抗 E選擇素、抗 P選擇素抗體對此階段的阻斷作用說明了選擇素在介導白細胞與內皮細胞起始粘附時的特異性作用；●起始階段粘完成后， L選擇素迅速從 細胞表面脫落，白細胞活化，其表面整合素粘附分子迅速上調。 由于選 擇素與其配基的親和力不高，粘附力較弱，故只能使白細胞疏松地貼在血管內皮上滾動。說明自由基也是粘附分子表 達的誘因之一。 綜合近年來有 關細胞因子和粘附分子在缺血－再灌注損傷時的變化夫律，以及我們的研究結果發(fā)現(xiàn)， IL1 在基因與蛋白水平的表達與內皮細胞粘附分子的表達相平行，卻較后者提前發(fā)生改變 [10 10 116]。腦缺血或腦血 管痙攣時 IL1 分泌較正常升高 [104109]。 IL1 通過內皮細胞表面的 I 類受體發(fā)揮多種生物學效應。腦再灌早期 ,在中性粒細胞上的 CD11/CD18 粘附分子及內皮細胞表面的 ICAM1 表達量增加的同時， NO 顯著下降，而應用外源性 L精氨酸提高 NO 后可減少中性粒細胞