免疫熒光技術(shù)-wenkub.com
2025-08-02 02:48 本頁面
【正文】 因未免疫動物的血清中無特異性抗體，應(yīng)呈陰性反應(yīng)。 做間接法免疫熒光染色，如何設(shè)置對照？ 最好是同一視野在未用熒光激發(fā)下進(jìn)行對照，看是否非特異性染色。 （ 4）切片在緩沖液或修復(fù)液中浸泡時間太長（大于 24小時）：原因尚不清楚，但現(xiàn)象 存在。 （ 2）抗體孵育時間過長或溫度較高：解決辦法是，嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程，最好隨身佩帶 報(bào)時表或報(bào)時鐘，及時提醒，避免因遺忘而造成時間延長。 （ 2）一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看。 一抗 4度孵育后為什么要進(jìn)行 37度復(fù)溫？ （ 1）一方面，防止切片從 4度直接放入 PBS易脫片； （ 2）另一方面，使抗原抗體結(jié)合更穩(wěn)定。 封閉血清的選擇原則是什么？ （ 1）膜上或切片上有剩余的位點(diǎn)可以非特異性吸附抗體，造成后續(xù)結(jié)果的假 陽性！ （ 2）封閉血清一般是和二抗同一來源的，血清中動物自身的抗體，預(yù)先能和 組織中有交叉反應(yīng)的位點(diǎn)發(fā)生結(jié)合，否則在后面的步驟中如果和二抗發(fā)生結(jié) 合，會造成背景。 在什么情況下使用 TritonX100 （ 1） Triton X100化學(xué)名稱為聚乙二醇辛基苯基醚，是一種去污劑。根 據(jù)此來源來選擇相應(yīng)的二抗。有的一抗只能用于 Western blotting，或免疫組化、免疫熒光、免疫 沉淀等；甚至表明石蠟切片或冰凍切片。單克隆抗 體能目標(biāo)明確地與單一的特異抗原決定簇結(jié)合，就像導(dǎo)彈精確地命中目標(biāo)一樣。 （ 3）石蠟切片的優(yōu)點(diǎn)可以保持組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，且容易存放在室溫，而冰凍切片比較麻煩，一定要存在 80度的低溫冰箱中。 免疫熒光技術(shù)常見問題 石蠟切片和冰凍切片的比較？ （ 1）要求做冰凍切片的不一定能做石蠟切片，因?yàn)樽魇炃衅瑫r要高溫烤片，可能會破壞組織的抗原性，如果組織的抗原性較穩(wěn)定，則可作石蠟切片；但是要求做石蠟切片的，可作冰凍切片。 （ 4） PBS的 PH和離子強(qiáng)度的使用和要求，建議 PH在 。 封片： 為了長期保存，我們一般用緩沖甘油等封片，此外還有專門的抗熒光萃滅封片液； 避免產(chǎn)生氣泡。 封閉是血清與非特異性位點(diǎn)結(jié)合，以消除非特異性染色，提高目的蛋白的準(zhǔn)確性和降低背景。 使不同組織成分對染料有不同的親和力，便于染色。 停止細(xì)胞中的生化反應(yīng)，固定其中的各種生化物質(zhì)狀態(tài)，防止細(xì)胞死亡后出現(xiàn)自溶分解。 FL2探測器檢測 PI。 FL3探測器檢測 PerCP。 21nm的帶通濾光片，雙激光器的流式細(xì)胞儀推薦使用575177。其他如堿性磷酸酶的底物 4甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基苯乙酸等。最大吸收光波長為 550nm，最大發(fā)射光波長為 620nm，呈現(xiàn) 橙紅色熒光 ，與FITC的翠綠色熒光對比鮮明，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧?。其主要?yōu)點(diǎn)是人眼對黃綠色較為敏感，通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。 目前常用于標(biāo)記抗體的熒光素有以下幾種： 異硫氰酸熒光 (fluorescein isothiocyanate, FITC) FITC純品為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水和酒精溶劑。 熒光探針： 能產(chǎn)生熒光的特異性生 物染料（ PI， DAPI）、 標(biāo)有熒光素的特異性蛋白結(jié)合物（熒光抗體）。 放大倍率小。 濾鏡對熒光信號衰減大，靈敏度和熒光強(qiáng)度不夠。 熒光顯微鏡的不足之處： 無法實(shí)現(xiàn)對熒光、透射光的同時采集，無法實(shí)現(xiàn)多重?zé)晒獾耐瑫r采集和共定位。 激光共聚焦掃描顯微鏡 （ Conf
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