【正文】 Hfr F– H fr + F– （在大多數(shù)情況下） Hfr F– H fr + Hfr （在極少數(shù)情況下） 接合中斷試驗與染色體圖： Hfr菌株與 F– 菌株接合與 F+ 菌株相似 ， 區(qū)別在于 F因子被分隔在核染色體組兩端 ， F因子的頭先進入受體細胞 ， 然后是核染色體組 ， 只有核染色體組完全進入受體細胞之后 ， F因子的尾才能進入受體菌細胞 ，完成 DNA的傳遞 。 因該菌株與 F– 接合后的重組頻率比 F+ 菌株高幾百倍而得名 。 這種 DNA復(fù)制機制稱為 滾環(huán)模型 （ rolling circle model） ； 在 F– 細胞中 ， 以外來的供體 DNA線狀單鏈為模板合成一條互補單鏈 ， 并隨之恢復(fù)成環(huán)狀雙鏈 F因子 。 ② F+（ “ 雄性 ” ） 菌株： 細胞內(nèi)含有 （ 1~4個 ） 游離的 F因子 ， 細胞表面存在與 F因子數(shù)目相當(dāng)?shù)男跃?。 通過接合而獲得新性狀的受體細胞就是 接合子（ conjugant） 1946年用 實驗： Met+bio+thr+leu+ Metbiothr+leu+ Met+bio+thrleu [] [] [] [] 混合培養(yǎng) 離心洗滌后 接合及其發(fā)現(xiàn) A B E. coli的 F因子：決定性別的質(zhì)粒，屬于附加體（ episome），可以通過接合作用獲得，也可以通過丫啶類化合物、溴化乙錠或絲裂霉素 C的處理而消除。 是為 高頻轉(zhuǎn)導(dǎo) 高頻轉(zhuǎn)導(dǎo) （ HFT， high frequency transduction） K12 (??)gal+(供體菌 ) ? (大量 ) + ?dgal+（ 105） (受體菌 ) ? dgal+ ? dgal+/ ? ? dgal+/ ?（雙重容源菌供體） ?(50%) + ?dgal+（ 50%） (受體菌 ) ? dgal+（轉(zhuǎn)導(dǎo)子） （雙重容源 轉(zhuǎn)導(dǎo)子） 高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)和低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)圖解 低頻轉(zhuǎn)導(dǎo) 高頻轉(zhuǎn)導(dǎo) . . 噬菌斑 感染 概念：當(dāng)溫和噬菌體感染宿主而使其發(fā)生溶源化時 ， 因噬菌體的基因整合到宿主的核基因組上 ， 而使后者獲得了除免疫性以外的新性狀的現(xiàn)象 ， 稱為溶源轉(zhuǎn)變 。 當(dāng)雙重溶源菌被紫外線等誘導(dǎo)時 ， 其中的 正常 λ 噬菌體的基因可補償 λdgal缺失的部分基因功能 ， 因而兩種噬菌體就同時獲得復(fù)制的機會 。 把這種裂解物稱為 LFT（ 低頻轉(zhuǎn)導(dǎo) ） 裂解物 。 特點 ： 噬菌體對供體菌和受體菌都是溫和噬菌體 只能轉(zhuǎn)導(dǎo)供體菌的個別特定基因 （ 一般為噬菌體整合位點兩側(cè)的基因 ） 該特定基因由 部分缺陷的噬菌體 攜帶 缺陷噬菌體是由于其在形成過程中所發(fā)生的低頻率 （ 約10 – 5） “ 誤切 ” ， 或由于 雙重溶源菌 的裂解而形成（ 約形成 50%缺陷噬菌體 ） 分類 ：低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)與高頻轉(zhuǎn)導(dǎo) 轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程 ?該溶源菌被誘導(dǎo)裂解時 ， 有極少數(shù) （ ~ 10 – 5） 的前噬菌體（ prophage） 發(fā)生不正常切離（ abnormal excesion） ， 其結(jié)果會將插入位點兩側(cè)之一的少數(shù)宿主基因 （ 如 ?前噬菌體的兩側(cè)分別為發(fā)酵半乳糖的 gal基因或合成生物素的 bio基因 ） 連接到噬菌體 DNA上 （ 而噬菌體也將相應(yīng)的一段 DNA遺留在宿主的染色體組上 ） ， 通過衣殼的 “ 誤包 ” ， 就形成了一種特殊的噬菌體 ——缺陷噬菌體（ defective phage） 。 在這種情況下 ， 由于一個受體細胞只感染了一個完全缺陷噬菌體 ， 故受體細胞不會發(fā)生往常的溶原化 ， 也不顯示其免疫性 ， 更不會裂解和產(chǎn)生正常的噬菌體；而由于導(dǎo)入的外源 DNA片段可與受體細胞核染色體組上的同源區(qū)段配對 ，在通過雙交換而整合到受體菌染色體組中 ， 所以使后者成為一個 遺傳性狀穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子 。 (普遍性 )轉(zhuǎn)導(dǎo)： plete transduction。 A B [] [] Try+his+ Tryhis+ Try+his 定義： 以溫和 噬菌體為媒介，將供體細胞的 DNA片段攜帶到受體細胞中，通過交換與整合，從而使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)。 自然轉(zhuǎn)化的普遍性： 人工轉(zhuǎn)化 人工轉(zhuǎn)化 ——是通過人為誘導(dǎo)的方法，使細胞具有攝取 DNA的能力，或人工地將 DNA導(dǎo)入細胞內(nèi)。 自然轉(zhuǎn)化 降解 吸附 切割成 4~5 106 單鏈入胞 同源部分配對、整合 復(fù)制分裂，只有一個子代DNA分子獲得供體基因 非轉(zhuǎn)化子 轉(zhuǎn)化子 到目前為止 ， 已發(fā)現(xiàn)能發(fā)生轉(zhuǎn)化作用的菌屬主要有： Streptococcus pneumoniae、 Haemophilus（ 嗜血桿菌屬 ） 、 Bacillus、Neisseria （ 奈瑟氏球菌屬 ） 、 Rhizobium （ 根瘤菌屬 ） 、Staphylococcus、 Pseudomonas和 Xanthomonas中多見 。 稍后 ， DNA酶即無影響 ， 說明此時該轉(zhuǎn)化因子已進入細胞； 切割 ：在吸附位點上的 DNA被核酸內(nèi)切酶分解 ， 形成平均分子量為 4~5 106的DNA片段； 入胞 ： DNA雙鏈中的一條單鏈被膜上的另一種核酸酶切除 ， 另一條單鏈逐步進入細胞 ， 這是一個耗能的過程 。 轉(zhuǎn)化頻率： 一般只有 ~1%， 最高時亦達 10%左右 。 感受態(tài)細胞的比例： 當(dāng)處于感受態(tài)高峰時 ， 群體中呈感受態(tài)的細胞因菌種而不同 . Bacillus subtilis不超過 10~15% Streptococcus pneumonia和 Haemophilus influenzae（ 流感嗜血桿菌 ）達到 100% 轉(zhuǎn)化 DNA的最低濃度： 在群體中含有 15%感受態(tài)細胞時 ，?gDNA/ml細胞懸液即可有效發(fā)生轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化因子： 轉(zhuǎn)化因子：本質(zhì)是供體 DNA片段 一般的轉(zhuǎn)化因子都是線狀雙鏈 DNA；也有少數(shù)報道認為線狀單鏈 DNA也有轉(zhuǎn)化作用 。轉(zhuǎn)化后的受體菌稱為 轉(zhuǎn)化子（ transformant）。 ② 利用雜交育種往往還可以消除某一菌株在經(jīng)過長期誘變處理后所出現(xiàn)的產(chǎn)量上升緩慢的現(xiàn)象 ， 因此 ， 它是一種重要的育種手段 。 雜交中必然包含著重組 ， 而重組則不限于雜交這一形式 。 ① 逐個檢出法： 缺陷 型 的檢出： ② 影印平板培養(yǎng)法 ③ 夾層培養(yǎng)法 ① 生長譜法 ? 方法簡便； ? 回變和污染不影響 結(jié)果 ? 測定物質(zhì)可為粉末 或紙片 缺陷型 的鑒定 ： 測定一般應(yīng)分兩階段： ? 第一階段：測定是哪類物質(zhì)的缺陷型； ? 第二節(jié)段：根據(jù)第一階段確定的范圍 ， 進一步確定是哪種具體化合物的 缺陷 型； ★ 缺陷型 的應(yīng)用 ? 作為菌株的遺傳標(biāo)記：進行基因工程、誘變育種、 研究代謝過程時用作親本標(biāo)記； ?作為生產(chǎn)菌種： aa、核苷酸等生產(chǎn)菌種； ?作為 aa、維生素、堿基的測定菌株。 完全培養(yǎng)基 （ CM） [+]：滿足一切 營養(yǎng)缺陷 型 菌株 生長的天然或半 合成 培養(yǎng)基。 如： lys + 。 舉例： ?由谷氨酸產(chǎn)生菌乳糖發(fā)酵短桿菌 2256，經(jīng)誘變處理得到溫度敏感變異株 Ts88: ?30℃ 培養(yǎng)時能正常生長 ?40℃ 時死亡，但能在富含生物素的培養(yǎng)基中積累谷氨酸（而野生型卻受生物素的反饋抑制）。 ? 初篩的目的：刪去明確不符合要求的大部分菌株，把生產(chǎn)性狀類似的菌株盡量保留下來，使優(yōu)良性狀的菌株不至于漏網(wǎng)； ——因此，初篩工作以量為主，測定的精確性還在其次；初篩手段應(yīng)盡可能快速、簡單。 目前 ， 艾姆斯試驗法 已廣泛用于檢測食品 、 飲料 、 藥物核引水等試樣中的致癌物 。 生產(chǎn)上經(jīng)常采用的劑量： 死亡率為 70%——80%左右。 處理劑量：常用照射時間或死亡率作為相對劑量。 ? 選擇誘變劑的種類： 在選用理化因子作誘變劑時 ， 在同樣效果下 ， 應(yīng)選用 最方便 的因素；而在同樣方便的情況下 ， 則應(yīng)選擇 最高效 的因素 。 誘變劑的合適劑量 ：凡在提高誘變率的基礎(chǔ)上 ， 能擴大變異幅度 ， 促使變異移向正變范圍的劑量 ， 就是合適的劑量 。 —致死率是最好的誘變劑相對劑量的表示方法。 方法： ①玻璃珠打散 1015min。 誘變育種： 是用物理或化學(xué)的誘變劑使誘變對象內(nèi)的遺傳物質(zhì)（ DNA） 的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變 ， 引起性狀變異并通過篩選獲得符合要求的變異菌株的一種育種方法 。 有四種酶參與 ——① 內(nèi)切核酸酶 在胸腺嘧啶二聚體的 5’一側(cè)切開一個 3’OH和 5’P的單鏈缺口； ② 外切核酸酶 從 5’P至 3’OH方向切除二聚體 ， 并擴大缺口； ③ DNA聚合酶 以 DNA的另一條互補鏈為模板 ， 從原有鏈上暴露的 3’OH端起逐個延長 ， 重新合成一段缺失的 DNA鏈； ④ 通過 連接酶 的作用 ， 把新合成的寡核苷酸的 3’OH末端與原鏈的 5’P末端相連接 ， 從而完成了修復(fù)作用 。 由于一般的微生物中都存在著光復(fù)活作用 ， 所以進行紫外線誘變育種時 ， 只能在紅光下照射及處理照射后的菌液 。 后來 ， 在許多微生物中都得到了證實 。在 互補雙鏈間 形成嘧啶二聚體的機會較少 。 嘧啶的光化產(chǎn)物主要是二聚體和水合物 。 例如 ， 據(jù)統(tǒng)計 ， 堿基對發(fā)生自發(fā)突變的幾率約為 10 –8 ~ 10 – 9。 ★ 由背景輻射和環(huán)境因素引起 ：天然的宇宙射線 ★ 互變異構(gòu)效應(yīng)： 堿基 T、 G的第六位上是酮基 ， 會以酮式或烯醇式兩種互變異構(gòu)的狀態(tài)出現(xiàn) C、 A的第六位上是氨基 ， 會以氨基式或亞氨基式兩種互變異構(gòu)的狀態(tài)出現(xiàn) 平衡一般趨向于酮式或氨基式 ， 在 DNA雙鏈結(jié)構(gòu)中一般總是以 A︰ T和 G┇ C堿基配對的形式出現(xiàn) 在偶然情況下 ， 在 DNA復(fù)制到達這一位臵的瞬間 ， 在 T以稀有的烯醇式出現(xiàn)時 ， 其相對位臵上就出現(xiàn) G 同樣 ， 如果 C以稀有的亞氨基形式出現(xiàn)在 DNA復(fù)制到達這一位臵的瞬間 ， 則在新合成 DNA單鏈中與 C相對應(yīng)的位臵上就將是 A。 幾種自發(fā)突變的可能機制 ★ 微生物自身有害代謝產(chǎn)物的誘變效應(yīng) ： 過氧化氫是普遍存在于微生物體內(nèi)的一種代謝產(chǎn)物 。 與必須整合到宿主染色體特定位臵上的一般溫和噬菌體不同 ， Mu噬菌體并沒有一定的整合位臵 。 轉(zhuǎn)座因子的種類 （ 2） 轉(zhuǎn)座子 （ Tn， transposon， 又稱轉(zhuǎn)位子 ， 易位子 ） ：與IS和 Mu噬菌體相比 ， Tn的分子量是居中的 （ 一般為2~25kb） 。 已知的 IS有 5種 ，即 IS IS IS IS4和 IS5。 轉(zhuǎn)座因子 （ transposible element） ： 在染色體組中或染色體組間能改變自身位臵的一段 DNA順序 。 染色體畸變 轉(zhuǎn)座因子 （ transposible element） 由 40年代 B. McClintock對的遺傳研究而發(fā)現(xiàn)染色體易位 ， 自 1967年以來 ，已在微生物和其它生物中得到普遍證實 ， 并已成為分子遺傳學(xué)研究中的一個熱點 。 丫啶類化合物誘發(fā)的移碼突變及其回復(fù)突變圖示： （ 3） 染色體畸變 （ chromosomal aberration） 某些理化因子 ， 如 X射線等的輻射及烷化劑 、 亞硝酸等 ，除了能引起點突變外 ， 還會引起 DNA的大損傷（ macrolesion） ——染色體畸變 ， 它包括： 染色體結(jié)構(gòu)上的變化： 缺失 （ deletion） 重復(fù) （ duplication） 易位 （ translocation） 倒位 （ inversion） 染色體數(shù)目的變化 ★ 染色體結(jié)構(gòu)上的變化 分為染色體內(nèi)畸變和染色體間畸變兩類 。 圖 814——能誘發(fā)移碼突變的幾種代表性化合物 引起移碼突變的誘變劑：主要是 吖啶類染料，如吖啶黃、吖啶橙等等。 （ 2） 移碼突變 frameshift mutation 或 phaseshift mutation， 指誘變劑使DNA分子中增加 （ 插入 ） 或缺失一個或少數(shù)幾個核苷酸 ，從而使該部位后面的全部遺傳密碼發(fā)生轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯錯誤的一類突變 。 以 5溴尿嘧啶 (5BU)為例： 5BU是胸腺嘧啶（ T）的 的 類似物 ，酮式的 5BU可以和 A配對， 烯醇式的 5BU 可以和 G配對，在 DNA分子復(fù)制的過程中，由于 5BU的插入和互變異構(gòu)導(dǎo)致堿基置換。 能引起顛換的誘變劑很少 ， 只是部分烷化劑才有 . 亞硝酸可以使堿基發(fā)生氧化脫氨作用。