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2025-04-01 23:13 本頁面
【正文】 2 抑制內(nèi)源性的RNA酶的活性細胞破碎時，RNA酶釋放出來，所以力爭在RNA提取的初始階段，通過加入RNA酶抑制劑來抑制內(nèi)源性的RNA酶的活性。RNA酶是RNA降解的主要原因，RNA酶是一類生物活性非常穩(wěn)定的酶，除細胞內(nèi)RNA酶外，環(huán)境中的灰塵、各種實驗器皿和試劑、人類皮膚的汗液、唾液中均存在RNA酶，且RNA酶耐熱、耐酸堿，煮沸也不能使之完全失活，蛋白變性劑可使之暫時失活，但變性劑去除后，又可恢復(fù)活性。 取各上清時,不應(yīng)貪多,以防非核酸類成分干擾。 酚一定要堿平衡。28S比18S亮點比較好，5S亮的話就說明RNA降解了35. 通過電泳看5s 18s 28s的情況，分解后5s變亮，18和28連成一片，呈彌散狀。由于DNA分子較RNA分子大許多，電泳遷移率低；而RNA中以rRNA最多，占到80%~85%，tRNA及核內(nèi)小分子RNA占15%~20%，mRNA占1%~5%。 尼龍膜的優(yōu)點是韌性好，與核酸結(jié)合的能力也相當(dāng)強，正可以彌補硝基纖維素膜的缺點，現(xiàn)已成為主流。 毛細管轉(zhuǎn)移法借助吸水紙吸收轉(zhuǎn)移緩沖液時所產(chǎn)生的牽引力量將RNA自洋菜膠體轉(zhuǎn)移至膜上；要轉(zhuǎn)印完全，起碼需要作用6 h以上。 3注意事項[1]嚴(yán)格遵守試驗規(guī)則，物必準(zhǔn)確。 [10]()中45min,使膠中和。 [6]上樣、同時加RNA標(biāo)記物（同位素（32P）dCTP）。 [2]等膠凝固后，去掉梳子和膠布，將盛膠槽放入1MSE緩沖液的電泳槽。非變性膠跑出來的蛋白能保持其活性一般用做功能試驗，如EMSA。 注意：①DEPC是 潛在的致癌物質(zhì)，在操作中應(yīng)盡量在通風(fēng)的條件下進行，并避免接觸皮膚。 DEPC氣味芳香濃烈，強揮發(fā)性，有毒，需在通風(fēng)櫥中操作。DEPC水是用DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)處理過并經(jīng)高溫高壓消毒的MiliQ純水。配1000ml的DEPC處理水，加1mlDEPC。4. RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。它通過和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，從而抑制酶的活性。不能高壓滅菌的試劑，應(yīng)當(dāng)用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制。2. % DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。完整的RNA電泳時，28S（）和18S（）rRNA經(jīng)EB染色后，兩條電泳條帶的顯色強度近似為2比1。均一的RNA取決于有效的去除RNA提取物中的DNA、蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)；完整的RNA則取決于最大限度地避免純化過程中內(nèi)源性及外源性RNase對RNA的降解。所用試劑應(yīng)未開封或RNA專用試劑。2．玻璃器皿沖洗干凈后，需180~250℃干烤4小時以上。3, 退火時間過長.4, 最重要的一點是,在引物設(shè)計過程中避免引物間有互補序列,尤其是339。4. TAE的 buffer capacity 比較差，gel 一般比較模糊，但它不會對影嚮酵素三種緩沖液的配制方法Tris乙酸（TAE）：50濃貯存液（每升）：242g Tris 堿 冰乙酸100ml ()使用時再稀釋50倍。20. TAE是Tris乙酸，緩沖容量小，但是溶解度大，易于儲存TBE是Tris硼酸，緩沖容量大，但是溶解度小，不易長期儲存，易產(chǎn)生沉淀TAE與TBE的區(qū)別首先要知道 TAE 與 TBE 緩衝溶液的成份如下：50x TAE Buffer (TrisAcetateEDTA) 242 gm Tris base ml Acetic acid 100ml EDTA Add ddH2O to 1 liter and adjust pH to .10x TBE Buffer (TrisBorateEDTA) 108 gm Tris base 55 gm Boric acid gm Na4EDTA Add ddH2O to 1 liter. The pH is and requires no adjustment.它們的分別有下列幾點：1. TBE 不能太濃 (它只可有 10 times)，因為 borate 會很容易沉澱，但一般有少許沉澱是不會有太大問題。⑶、試劑的質(zhì)量所用的CaCl2等試劑均需是最高純度的，并用最純凈的水配制，最好分裝保存于4℃。⑵、質(zhì)粒DNA的質(zhì)量和濃度用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài)的，轉(zhuǎn)化率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當(dāng)加入的外源DNA的量過多或體積過大時，則會使轉(zhuǎn)化率下降。（應(yīng)注意OD600值與細胞數(shù)之間的關(guān)系隨菌株的不同而不同）。不要用已經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接，及貯存在4℃的培養(yǎng)菌液。低濃度膠易碎，小心操作和使用質(zhì)量好的瓊脂糖是解決辦法。一個好的緩沖系統(tǒng)應(yīng)有較強的緩沖能力，是溶液兩極的pH保持基本不變。這樣就能避免質(zhì)粒和基因沒有切動或者被切散。NEBuffer的組成及內(nèi)切酶在不同緩沖液中的活性見《內(nèi)切酶在不同緩沖液里的活性表》及每支酶的說明書。為了防止星活性的出現(xiàn)，所有限制性內(nèi)切酶反應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)條件下(特別是pH、離子強度、二價離子濃度的條件下)進行。 另外，實際上幾乎所有的限制性內(nèi)切酶都可能產(chǎn)生Star活性。另外，Star活性除了與酶本身的性質(zhì)有關(guān)外，與甘油濃度，pH值及離子濃度有關(guān)。13. 所謂星活性又稱Star活性。– SDS遇到鉀離子后變成十二烷基硫酸鉀（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是不溶于水的，而高濃度的鹽使得沉淀更完全。因此，在裂解細菌時要注意：第一，時間不能過長，因為在這樣的堿性條件下DNA片斷會慢慢斷裂；第二，混合必須輕柔，不然DNA也會斷裂。 在Oligo(dT) 存在下去除mRNA 的poly(A)尾11. 當(dāng)菌體在NaOH和SDS溶液中裂解時，蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生變性，當(dāng)加入中和液后，質(zhì)粒DNA
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