【正文】 Centrifugation Protein fraction Protein precipitation Protein fraction 1 or 2 purification steps Semipurified protein 34 purification steps Homogeneous protein Sterile bottling To pharmaceuticals market Lyophilisation Bottling To chemicals market C 細(xì)胞 膜蛋白質(zhì) 1．為什么說色譜分離的效率是所有分離純化技術(shù)中最高的 ? 2．各種色譜分離 (吸附、分配、離子交換、凝膠、親和 )的機(jī)理是什么 ? 3．分析色譜與制備和工業(yè)色譜的主要區(qū)別是什么 ? 4．色譜分離中吸附劑的基本要求是什么 ?常用色譜載體基質(zhì)材料有哪些 ? 5 ．親和色譜載體中引入“手臂”的原理是什么 ? 6．含有 3種溶質(zhì) A、 B、 C的混合液，它們與固定相的作用力依次增強(qiáng) (即 A＜ B＜ C)，其濃度分別為 A： ％、 B： ％、 C： ％。 親和色譜分離纖維蛋白溶酶和纖維蛋白溶酶原分析系統(tǒng)圖 1–切換閥門； 2 –泵 (1ml／ min)； 3 –調(diào)節(jié)閥； 4 –壓力表； 5 –注樣器； 6 –過濾器； 7 –色譜柱 (25—30℃ )； 8 –螢光檢出器 (蛋白質(zhì)用 )； 9 –集樣器 (4℃ )； 10 –兩點(diǎn)記錄儀； 11 –蠕動(dòng)泵； 12 –壓力表； 13 –反應(yīng)盤管 (37℃ )； 14 –螢光檢出器 (酶活性測定定用 ) 高效液相層析（ HPLC） ? 特點(diǎn)： ①使用的固相支持劑顆粒很細(xì)，表面積很大,因而分辨率很高。 親和色譜操作和應(yīng)用 親和色譜分離在生物制品分離和分析領(lǐng)域有寬廣的應(yīng)用開發(fā)前景 。作為“手臂”的烴鏈可以先連接于載體，再通過它連接于配基上。 常規(guī)的親和色譜載體都是以軟質(zhì)凝膠，諸如葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯酰胺等作為載體材料的。這使親和色譜吸附劑的商品化受到限制。前者的配基僅對某種生物物質(zhì)有特別強(qiáng)的親和性，如單克隆抗體對抗原的特異性吸附就屬此類。它基于固定相的配基與生物分子間的特殊生物親和能力的不同來進(jìn)行分離。 線性梯度洗脫過程中溶質(zhì) A和 B 在 IEC柱的移動(dòng)和洗脫曲線 溶質(zhì)的移動(dòng)速度不斷增大，直至與流動(dòng)相流速相同 (m→ 0) 改變流動(dòng)相離子強(qiáng)度的增大速度 (即濃度梯度 )，可調(diào)整溶質(zhì)的洗脫體積，即溶質(zhì)洗脫峰之間的距離，在改善分離度的同時(shí)縮短洗脫時(shí)間。 一方面，蛋白質(zhì)的分配系數(shù)對離子強(qiáng)度非常敏感， 離子強(qiáng)度的微小改變，就會(huì)引起分配系數(shù)的很大變化；另一方面，不同蛋白質(zhì)的 B值可能相差很大，即在同一離子強(qiáng)度下不同蛋白質(zhì)分配系數(shù)可能相差非常大 (幾個(gè)數(shù)量級(jí) )。陽離子交換基有 CM(羧甲基，適用范圍 pH＞ 4)， P(磷酸基 )和 SP(磺丙基 )。 離子交換 (Ion exchange chromatography， IEC) 離子交換色譜利用離子交換劑為固定相，根據(jù)帶電溶質(zhì)與離子交換劑之間靜電相互作用力的差別進(jìn)行溶質(zhì)分離。 3．相對分子質(zhì)量的測定 凝膠過濾介質(zhì)的分級(jí)范圍內(nèi)蛋白質(zhì)的分配系數(shù)與相對分子質(zhì)量的對數(shù)呈線性關(guān)系，所以 GFC可用于未知物質(zhì)相對分子質(zhì)量的測定。 3. 料液濃度 分離操作中發(fā)現(xiàn)， 當(dāng)料液濃度較高時(shí)，洗脫曲線常呈現(xiàn)不對稱形狀 ，如 出現(xiàn)吐舌或拖尾，甚至出現(xiàn)分裂的兩個(gè)峰，使 HETP急劇增大 。 Sepharose是常用的瓊脂糖凝膠品牌之一，機(jī)械強(qiáng)度較低。因此， GFC操作一般采用組成一定的洗脫液進(jìn)行洗脫展開，這種洗脫法稱為恒定洗脫法 (isocratic elution)。 反相介質(zhì)性能穩(wěn)定，分離效率高，可分離蛋白質(zhì)、肽、氨基酸、核酸、甾類、脂類、脂肪酸、糖類、植物堿等含有非極性基團(tuán)的各種 物質(zhì)。常用反相填料有： C18（ ODS）、 C8（ MOS）、 C4（ Butyl）、 C6H5（ Phenyl） 等。 徑向色譜 (Radial Flow Chromatographic column) 徑向色譜操作裝置示意圖 1—預(yù)平衡液 2—樣品 3—流動(dòng)相 4—閥 5—泵 6—徑向色譜柱 7—流量計(jì) 8—壓力表 9—檢測器 10—記錄儀 徑向色譜柱在生物制劑、血液制品及基因工程產(chǎn)品等方面已廣泛使用，其結(jié)果優(yōu)于傳統(tǒng)的軸向色譜柱。 提高給料流量是增加生產(chǎn)能力的更有效的方法。一般為實(shí)現(xiàn)溶質(zhì)間的良好分離， Rs值應(yīng)在 。 為提高分離效果，可通過降低流速 u或減小固定相粒徑 [即式中的 C值 ]來降低 HETP，提高理論板數(shù)。 通常將溶質(zhì)達(dá)到一次分配平衡的色譜柱段稱為一個(gè)理論板 (theoretical plate)，該柱段高度即理論板當(dāng)量高度(heigh equivalent to a theoretical plate， HETP)。 根據(jù)傳質(zhì)理論，色譜分離的傳質(zhì)過程可表示為： 1 傳質(zhì)單元高度與傳質(zhì)單元數(shù) (748) )( *CCkadzdCu ??對于球形顆粒： pda )1(6 ??? (749) d p —— 固定相顆粒直徑 。以流出液體積對溶質(zhì)濃度作圖，也可得到一階梯圖，每一個(gè)階梯只有一種成分。 三組分前沿分析流出液組成圖形 開始時(shí)，溶質(zhì)全部吸收在固定相內(nèi)，流出液為純?nèi)軇?；?jīng)一段時(shí)間洗脫后，與固定相作用力最弱的 A物質(zhì)首先被洗脫出來，出現(xiàn)第1個(gè)階梯；隨后作用力較強(qiáng)的 B物質(zhì)和更強(qiáng)的 C物質(zhì)也先后流出，分別形成第 2個(gè)、第 3個(gè)階梯，直至穩(wěn)定不變。當(dāng)溶液通過固定相時(shí)，不同組分根據(jù)與固定相作用力強(qiáng)弱不同，產(chǎn)生不同的移動(dòng)速率。逐次洗脫法設(shè)備要求也較簡單，重現(xiàn)性較好，故常用于較大規(guī)模色譜分離。操作時(shí)，先將樣品輸入色譜柱，隨即加入一種不與固定相發(fā)生作用的溶劑或幾種溶劑的混合物作為流動(dòng)相沖洗。 (三 )檢測器與流分收集器 溶劑性質(zhì)須適應(yīng)所用固定相，大量樣品溶液導(dǎo)入色譜柱后不馬上擴(kuò)散，集中在柱頭，不會(huì)在柱內(nèi)展開。 柱徑增加可使樣品負(fù)載量成平方地增加，但柱徑大時(shí)，流動(dòng)很難均勻，色帶不易規(guī)則，分離效果差；柱徑太小時(shí)，進(jìn)樣量少，且使用不便，裝柱困難。 5．聚乙烯醇 柱色譜裝置一般由進(jìn)樣、流動(dòng)相供給、色譜柱、檢測及流分收集器等部分構(gòu)成，其中色譜柱是色譜分離裝置的關(guān)鍵部件。它主要用于凝膠過濾法和凝膠電泳法的生物大分子的分離中。它同樣可以進(jìn)行化學(xué)修飾，以滿足不同的需要。凝膠的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性也很好。 瓊脂糖顆粒中帶有大量的－ OH基團(tuán)， 親水性好， 且可以方便地進(jìn)行化學(xué)修飾，接上一些官能團(tuán)，以便與某些接枝“手臂”或配基共價(jià)結(jié)合，適應(yīng)于各種色譜分離技術(shù)。但活性炭生產(chǎn)原料不同，制備方法及規(guī)格不一，其 吸附力不像氧化鋁、硅膠那樣容易控制，因此應(yīng)用不廣 。 (一 )無機(jī)基質(zhì)吸附劑 用作分離介質(zhì)的硅膠是人工合成的多孔二氧化硅，其表面含有很多硅羥基團(tuán)，可以進(jìn)行表面化學(xué)修飾 (化學(xué)鍵合 )或改性。 當(dāng)具有不同分子量物質(zhì)的混合液流經(jīng)凝膠柱時(shí)，其 Kd值的大小就決定了物質(zhì)的流出順序，即 Kd值小的先流出， Kd值大的后流出。 (728) (729) (730) 凝膠色譜柱的總體積 Vt分為 3部分： miot VVVV ???Vo為凝膠顆粒之間空隙的總體積； Vi為凝膠顆粒內(nèi)部空隙總體積； Vm為凝膠顆?；|(zhì)本身所占體積。