【正文】 噬菌體裂解第一個(gè)宿主時(shí)可能有三種情況： 1）包入的完全是噬菌體的 DNA（ 正常噬菌體 ） 2）包入的完全是細(xì)菌 DNA（ 完全缺陷噬菌體 ） 3）部分帶有噬菌體基因的 DNA（ 部分缺陷噬菌體 ） 轉(zhuǎn)導(dǎo)分別是由后兩種噬菌體參與進(jìn)行的。 ?在這種情況下，由于一個(gè)受體細(xì)胞只感染了一個(gè)完全缺陷噬菌體，故受體細(xì)胞不會(huì)發(fā)生往常的溶原化，也不顯示其免疫性，更不會(huì)裂解和產(chǎn)生正常的噬菌體；而由于導(dǎo)入的外源 DNA片段可與受體細(xì)胞核染色體組上的同源區(qū)段配對(duì)，在通過(guò)雙交換而整合到受體菌染色體組中，所以使后者成為一個(gè) 遺傳性狀穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子。 ? (普遍性 )轉(zhuǎn)導(dǎo)： plete transduction 。 ? 與轉(zhuǎn)化的區(qū)別： – 病毒或噬菌體并非遺傳基因的供體菌 – 中間不發(fā)生任何遺傳因子的交換或整合 – 最后不產(chǎn)生具有雜種性質(zhì)的轉(zhuǎn)化子 [] [] [] Tryhis+ Try+his Try+his+ 混合培養(yǎng) A B 三、轉(zhuǎn)導(dǎo)（ transduction） （ 1952）在 Salmonella typhimurium（鼠傷寒沙門(mén)氏菌）中發(fā)現(xiàn)的。但即使在轉(zhuǎn)化率極高的菌種中，其不同菌株間也不一定都能發(fā)生轉(zhuǎn)化。 – 腸桿菌科的一些細(xì)菌很難進(jìn)行轉(zhuǎn)化，主要原因一方面由于外來(lái) DNA難以摻入到細(xì)胞中，另一方面在受體細(xì)胞內(nèi)常存在可降解線形 DNA的核酸酶。這時(shí)如用低濃度溶菌酶處理，因它提高了細(xì)胞壁的通透性，故可提高轉(zhuǎn)化頻率； – 重組 ：來(lái)自供體菌的單鏈 DNA片段在細(xì)胞內(nèi)與受體細(xì)胞核染色體組上的同源區(qū)配對(duì)，接著受體染色體組上的相應(yīng)單鏈片段被切除，并被外來(lái)的單鏈 DNA交換、整合和取代，于是形成了一個(gè)雜合 DNA區(qū)段（ heterozygous region）。 自然轉(zhuǎn)化 . 轉(zhuǎn)化的過(guò)程 ? 以 S. Pneumonia strr（肺炎鏈球菌抗鏈霉素菌株）為例，大致可分為六階段： – 吸附 ：雙鏈 DNA片段與細(xì)胞表面的特定位點(diǎn)（主要在新形成細(xì)胞壁的赤道區(qū)）結(jié)合，此時(shí)，細(xì)胞膜上的膽堿可促進(jìn)這一過(guò)程。而粗制的 DNA則分子量較大。 有人計(jì)算 ， 在 H. Influenzae上有 4~10個(gè) ， 而在S. Pneumonia上則有 30~80個(gè) 。 – 感受態(tài)由細(xì)胞的遺傳性決定，但同時(shí)也受環(huán)境因子的影響： cAMP、 Ca2+等最明顯。 ? 雜交育種的缺點(diǎn)： 由于原生質(zhì)體融合技術(shù)獲得巨大的成功后，才使重組育種技術(shù)獲得了飛速的發(fā)展。 – 而一般所說(shuō)的雜交（ hybridization）則是細(xì)胞水平上的一個(gè)概念。 Ames test 方法示意圖 第三節(jié) 基因重組和雜交育種 ? 定義：凡把兩個(gè)不同性狀個(gè)體內(nèi)的遺傳基因轉(zhuǎn)移到一起，經(jīng)過(guò)遺傳分子間的重新組合，形成新遺傳型個(gè)體的方式，稱(chēng)為基因重組（ gene rebination）或遺傳重組。 方法：將菌培養(yǎng)在含抗生素的 MM基中 ② 菌絲過(guò)濾法 ?適用于： 絲狀（放線菌、霉菌） ?原理： 基本培養(yǎng)基上只有發(fā)育成菌絲； auxo孢子可通過(guò)濾膜，野生型菌絲不能通過(guò)。 營(yíng)養(yǎng)缺陷型 (auxotroph)的篩選 ★ 與篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株有關(guān)的三類(lèi)培養(yǎng)基 基本培養(yǎng)基 （ MM） []： 凡是能 滿(mǎn)足野生型菌株?duì)I養(yǎng)要求 的 最低成分的 合成培養(yǎng)基 。 如： lys ， bio 野生型 ： 自然界分離到的任何微生物，在其發(fā)生營(yíng)養(yǎng)缺陷突變前的原始菌株，為該微生物的野生型。 以選育高產(chǎn)突變株為例，誘變育種的基本環(huán)節(jié)概括如下： 第一輪： 一個(gè)出發(fā)菌株 →→→選出 200個(gè)菌株 →→→選出 50株 →→→選出 5株 誘變處理 初篩 （每瓶一株） 復(fù)篩 （每瓶四株） 第二輪： 5個(gè)出發(fā)菌株 →→→ →→ → 選出 50株 →→ →選出 5株 40株 40株 40株 40株 40株 誘變處理 初篩 復(fù)篩 （每瓶一株） （每瓶四株） 變異菌的一般篩選方法 平皿快速檢測(cè)法 ? 變色圈法 ? 透明圈法 ? 生長(zhǎng)圈法 ? 抑菌圈法 ? 梯度平板法 搖瓶培養(yǎng)法 特殊變異菌的篩選方法： 以 溫度敏感突變 為例： 篩選方法： 用途：常用于提高代謝物產(chǎn)量 原因： 是由于某一酶蛋白結(jié)構(gòu)改變后 ， 在高溫下活力喪失 重要性： 如果此酶為蛋白質(zhì) 、核酸合成途徑中所需的酶 ，則此變異株在高溫下的表型就是營(yíng)養(yǎng)缺陷型 。 誘變處理方式： 單一因子處理： 復(fù)合因子處理： 兩種以上因素 先后使用 同時(shí)使用 單一因子重復(fù)使用 常用誘變劑的使用方法 4. 菌種篩選 篩選方案： ? 實(shí)際工作中，為了提高篩選效率，往往將篩選工作分為初篩和復(fù)篩兩步進(jìn)行。 在物理誘變劑中 ， 尤以 紫外線為最方便 ， 而在化學(xué)誘變劑中 ， 一般可選用誘變效果最為顯著的 “ 超誘變劑 ” ， 如 NTG。 制備： 物理誘變劑 ——生理鹽水（ %NaCl) 化學(xué)誘變劑 ——緩沖液 濃度： 細(xì)菌、放線菌 108個(gè) /ml 霉菌、酵母菌 106個(gè) /ml 表型遲延現(xiàn)象 :指某一突變?cè)?DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂后，才在表型上顯示出來(lái)，造成不純的菌落。 當(dāng)前發(fā)酵工業(yè)和其他微生物生產(chǎn)部門(mén)所使用的高產(chǎn)菌株 ， 幾乎毫無(wú)例外地都是通過(guò)誘變育種而明顯提高其生產(chǎn)性能的 。 通常先繪制照射時(shí)間與死亡率的關(guān)系曲線，然后選擇合適的劑量。 紫外誘變方法 : 設(shè)備：紫外燈、磁力攪拌器、暗室等， 紫外燈：波長(zhǎng)為 25 7nm, 功率是 15W 處理時(shí)的照射距離： 20cm — 30cm 樣品：要直接暴露在紫外燈下，厚度不能超過(guò) 3mm 照射時(shí)，要用 磁力攪拌器攪拌。有四種酶參與 ——① 內(nèi)切核酸酶 在胸腺嘧啶二聚體的 5’一側(cè)切開(kāi)一個(gè) 3’OH和 5’P的單鏈缺口；② 外切核酸酶 從 5’P至 3’OH方向切除二聚體，并擴(kuò)大缺口；③ DNA聚合酶 以 DNA的另一條互補(bǔ)鏈為模板，從原有鏈上暴露的 3’OH端起逐個(gè)延長(zhǎng)，重新合成一段缺失的 DNA鏈；④通過(guò) 連接酶 的作用，把新合成的寡核苷酸的 3’OH末端與原鏈的 5’P末端相連接，從而完成了修復(fù)作用。 ? 由于一般的微生物中都存在著光復(fù)活作用，所以進(jìn)行紫外線誘變育種時(shí)，只能在紅光下照射及處理照射后的菌液。后來(lái)，在許多微生物中都得到了證實(shí)。在 互補(bǔ)雙鏈間 形成嘧啶二聚體的機(jī)會(huì)較少。嘧啶的光化產(chǎn)物主要是二聚體和水合物。在上鏈中，標(biāo)記B處發(fā)生“環(huán)出”，故只有 A及 C能獲得復(fù)制， 從而發(fā)生自發(fā)突變。例如，據(jù)統(tǒng)計(jì)，堿基對(duì)發(fā)生自發(fā)突變的幾率約為 10 –8 ~ 10 – 9。 ★ 互變異構(gòu)效應(yīng)： ? 堿基 T、 G的第六位上是酮基，會(huì)以酮式或烯醇式兩種互變異構(gòu)的狀態(tài)出現(xiàn) ? C、 A的第六位上是氨基，會(huì)以氨基式或亞氨基式兩種互變異構(gòu)的狀態(tài)出現(xiàn) ? 平衡一般趨向于酮式或氨基式，在 DNA雙鏈結(jié)構(gòu)中一般總是以 A︰ T和G┇ C堿基配對(duì)的形式出現(xiàn) ? 在偶然情況下，在 DNA復(fù)制到達(dá)這一位置的瞬間，在 T以稀有的烯醇式出現(xiàn)時(shí)，其相對(duì)位置上就出現(xiàn) G ? 同樣，如果 C以稀有的亞氨基形式出現(xiàn)在 DNA復(fù)制到達(dá)這一位置的瞬間，則在新合成 DNA單鏈中與 C相對(duì)應(yīng)的位置上就將是 A。 ? 幾種自發(fā)突變的可能機(jī)制 ? ★微生物自身有害代謝產(chǎn)物的誘變效應(yīng) ： – 過(guò)氧化氫是普遍存在于微生物體內(nèi)的一種代謝產(chǎn)物。與必須整合到宿主染色體特定位置上的一般溫和噬菌體不同，Mu噬菌體并沒(méi)有一定的整合位置。 轉(zhuǎn)座因子的種類(lèi) （ 2） ? 轉(zhuǎn)座子（ Tn， transposon，又稱(chēng)轉(zhuǎn)位子，易位子） ： IS和 Mu噬菌體相比， Tn的分子量是居中的（一般為 2~25kb）。 已知的 IS有 5種 ， 即 IS IS IS IS4和 IS5。 ? 轉(zhuǎn)座因子（ transposible element） ： 在染色體組中或染色體組間能改變自身位置的一段 DNA順序。 染色體畸變 轉(zhuǎn)座因子 （ transposible element） ? 由 40年代 B. McClintock對(duì)的遺傳研究而發(fā)現(xiàn)染色體易位，自 1967年以來(lái)，已在微生物和其它生物中得到普遍證實(shí)，并已成為分子遺傳學(xué)研究中的一個(gè)熱點(diǎn)。 丫啶類(lèi)化合物誘發(fā)的移碼突變及其回復(fù)突變圖示： （ 3） 染色體畸變 （ chromosomal aberration） ? 某些理化因子，如 X射線等的輻射及烷化劑、亞硝酸等，除了能引起點(diǎn)突變外，還會(huì)引起DNA的大損傷（ macrolesion） ——染色體畸變，它包括： – 染色體結(jié)構(gòu)上的變化： – 缺失（ deletion） – 重復(fù)（ duplication） – 易位（ translocation） – 倒位（ inversion） – 染色體數(shù)目的變化 ★ 染色體結(jié)構(gòu)上的變化 ? 分為染色體內(nèi)畸變和染色體間畸變兩類(lèi)。 圖 814——能誘發(fā)移碼突變的幾種代表性化合物 引起移碼突變的誘變劑：主要是 吖啶類(lèi)染料，如吖啶黃、吖啶橙等等。 （ 2） 移碼突變 ? frameshift mutation 或 phaseshift mutation，指誘變劑使 DNA分子中增加（插入）或缺失一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)核苷酸，從而使該部位后面的全部遺傳密碼發(fā)生轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯錯(cuò)誤的一類(lèi)突變。 以 5溴尿嘧啶 (5BU)為例： 5BU是胸腺嘧啶（ T）的 的 類(lèi)似物 ，酮式的 5BU可以和 A配對(duì)， 烯醇式的 5BU 可以和 G配對(duì)，在 DNA分子復(fù)制的過(guò)程中，由于 5BU的插入和互變異構(gòu)導(dǎo)致堿基置換。 若干誘變劑的作用機(jī)制及誘變功能 誘變因素 在 DNA上的初級(jí)效應(yīng) 遺傳效應(yīng) 堿基類(lèi)似物 摻入作用 AT=GC雙向轉(zhuǎn)換 羥 胺 與胞嘧啶起反應(yīng) GC→AT的轉(zhuǎn)換 亞硝酸 A、 G、 C的氧化脫氨作用 AT=GC雙向轉(zhuǎn)換 交 聯(lián) 缺失 烷化劑 烷化堿基（主要是 G） AT=GC雙向轉(zhuǎn)換 烷化磷酸基團(tuán) AT→TA的顛換 喪失烷化的嘌呤 GC→CG的顛換 糖 磷酸骨架的斷裂 巨大損傷（缺失、重復(fù)、倒位、易位） 丫啶類(lèi) 堿基之間的相互作用（雙鏈變形） 碼組移動(dòng)（＋或－） 紫外線 形成嘧啶的水合物 GC→AT轉(zhuǎn)換 形成嘧啶的二聚體 碼組移動(dòng)（＋或－） 交 聯(lián) 電離輻射 堿基的羥基化核降解 AT=GC雙向轉(zhuǎn)換 DNA降解 碼組移動(dòng)（＋或－） 糖 磷酸骨架的斷裂 巨大損傷（缺失、重復(fù)、倒位、易位） 喪失嘌呤 加熱 C脫氨基 CG→TA轉(zhuǎn)換 Mu噬菌體 結(jié)合到一個(gè)基因中間 碼組移動(dòng) 亞硝酸可以使堿基發(fā)生氧化脫氨作用。例如亞硝酸、羥胺和各種烷化劑（硫酸二乙酯，甲基磺酸乙酯， N甲基 N’硝基 N亞硝基胍， N甲基 N亞硝基脲，乙烯亞胺，環(huán)氧乙酸，氮芥等）。 對(duì)某一具體誘變劑來(lái)說(shuō)，即可同時(shí)引起轉(zhuǎn)換與顛換，也可只具其中的一種功能。 ? 按照遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的特點(diǎn)討論幾種有代表性的誘變劑的作用機(jī)制。 平板影印培養(yǎng)不僅在微生物遺傳理論的研究中有重要應(yīng)用，而且在育種時(shí)間和其它研究中均有應(yīng)用，值得很好地領(lǐng)會(huì)。待這些平板培養(yǎng)后，對(duì)各平板相同位置上的菌落作對(duì)比后，就可選出適當(dāng)?shù)耐蛔冃途辍? 1. 變量試驗(yàn)fluctuation test 2.涂布試驗(yàn) 原理與變量試驗(yàn)相同，方法更為簡(jiǎn)便，且可計(jì)算突變率。 – 從 1943年起，經(jīng)過(guò)幾個(gè)嚴(yán)密而巧妙的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，主要攻克了檢出在接觸抗性因子前已產(chǎn)生的自發(fā)突變株的難題，終于解決了這場(chǎng)紛爭(zhēng)。但在過(guò)去相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)對(duì)這種抗性產(chǎn)生的原因