【正文】 6. 大規(guī)模培養(yǎng)植物細胞的特點和主要的生物反應器類型。原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、細胞系和細胞株、粘附型細胞、接觸抑制、有限細胞系和無限細胞系，愈傷組織、外植體、懸浮培養(yǎng)、植板率。 11:胞質(zhì)雜種細胞 ? 。 完整細胞 胞質(zhì)體 核質(zhì)體 微細胞小細胞 ? 3:親本細胞 。 ?核 質(zhì) 體（ karyoplast）：由胞 質(zhì) 體分離出 來的核， 帶 有少量胞 質(zhì)并圍 有 質(zhì) 膜的 結(jié)構(gòu) 。 ? FITC(異 硫 氰 酸 熒光素 )在 熒 光 顯 徽 鏡下呈 綠 色 ? RITC (異 硫 氰 酸羅 丹明 ) 在 熒 光 顯 徽鏡 下呈 紅 色 熒光標記 互 補選擇 法是指利用 兩個親 本具有不同 遺傳 和生理特性 ,在特定培 養(yǎng)條 件下 ,只有 發(fā) 生互 補 作用的 雜種細 胞才能生 長 的 選擇 方法。 使用 濃 度： % 酚藏花紅染色法 酚藏花紅（ %) 能使無活力的原生質(zhì)體染成紅色，有活力的原生質(zhì)體不著色。 優(yōu) 點：可以收集到 數(shù) 量 較大的 純凈 原生 質(zhì) 體，同 時避免收集 過 程中原生 質(zhì) 體因相互 擠壓 而破碎 。 飄浮法 沉降法（過濾－離心法） 利用比重原理，在具有一定滲透 壓 的溶液中，先 進 行 過濾 然后低速離心，使 純凈 完整的原生 質(zhì) 體沉 積 于 試 管底部。 常用的酶種類 纖維 素酶 類 （ 纖維 素酶、半 纖維 素酶、崩潰 酶 [Driselase]）、果 膠 酶 類 （果 膠 酶和離析酶 [Macerozyme]）、 蝸 牛酶和 胼胝質(zhì) 酶。 原生質(zhì)體的分離 機械分離法 指 將 材料放入能降解 細 胞壁的混合 等滲酶液 中保 溫 一定 時間 ，在酶液的作用下， 細 胞壁被降解，從 而 獲 得大量有活力的原生 質(zhì) 體的方法。以及 莖 尖、根尖、子葉和胚性 組織 。 1 2 34 5 6優(yōu)點： 融合率高，達 70％－ 80％，甚至 100％ 可在顯微鏡下定向誘導細胞融合 可直接挑選雜種細胞 重復性強、對原生質(zhì)體傷害??；裝置精巧、方便簡單；免去 PEG誘導后的洗滌過程、誘導過程可控制性強等。 + + + + + 偶極子 電誘導法原理 + + ①電泳：在電極的作用下，原生質(zhì)體泳到一起，建立一個膜接觸狀態(tài)，形成念珠鏈。 煙草葉肉原生質(zhì)體 在高 Ca2+（ CaCl2）和高 pH（ ）條件下能很快誘發(fā)融合（ 37℃ ），但融合頻率不很高，高 pH也影響原生質(zhì)體的存活率，且易誘發(fā)多個原生質(zhì)體融合。 聚乙二醇（ PEG） 誘導 融合 機制 ：一般認為是 Na+造成了膜電位的改變。 病毒誘導融合優(yōu)缺點 常用的病毒：（ Sendal virus), 又稱日本血凝病毒 （ Hemagglutinating virus of Japan,HVJ） 屬于副粘液病毒科， RNA病毒，圓球形， 1962年，日本仙臺東北大學學者岡田發(fā)現(xiàn)仙臺病毒可誘導細胞融合。 用作融合 劑 的病毒必 須 事先用 紫外 線 或 β丙 內(nèi)酯滅 活 ，使病毒的感染活性 喪 失而保留病毒的融合活性。 特點： （ 1）反應器培養(yǎng)狀態(tài)恒定，保持細胞在優(yōu)化狀態(tài)下生長； （ 2）適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)； (3)操作復雜、增加污染機會、細胞變異、設備儀器要求高 動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術 ?懸浮培養(yǎng) ?貼壁培養(yǎng) ?固定化培養(yǎng) 微載體培養(yǎng)技術 大載體培養(yǎng)技術 多孔載體培養(yǎng) 微囊化培養(yǎng)技術 中空纖維細胞培養(yǎng)技術 第三節(jié) 細胞融合技術 是指在外力的作用下，兩個以上的異源（種、屬）細胞或原生質(zhì)體互相接觸，不經(jīng)過有性過程而發(fā)生膜融合、胞質(zhì)融合和核融合并形成一個雜合細胞的現(xiàn)象。 半連續(xù)式培養(yǎng) 指在分批式培養(yǎng)的基礎上 ， 將分批培養(yǎng)的培養(yǎng)液部分取出 ， 并補充加入等量的新鮮培養(yǎng)基 ， 使反應器內(nèi)培養(yǎng)液的總體積保持不變 。 1 . 0 0對氨基苯甲酸200 . 0 0 5維生素 B 1 2392 0 . 0 0L 纈氨酸191 . 0 0鹽酸硫胺素382 3 . 1 9L 酪氨酸180 . 2 0核黃素375 . 0 0L 色氨酸171 . 0 0鹽酸吡哆醇362 0 . 0 0L 蘇氨酸163 . 0 0氯化膽堿353 0 . 0 0L 絲氨酸151 . 0 0煙酰胺342 0 . 0 0L 脯氨酸143 5 . 0 0i 肌醇331 5 . 0 0L 苯丙氨酸131 . 0 0葉酸321 5 . 0 0L 甲硫氨酸120 . 2 5D 泛酸鈣314 0 . 0 0L 賴氨酸鹽酸鹽110 . 2 0生物素305 0 . 0 0L 亮氨酸103 0 0 . 0 0L 谷氨酰胺295 0 . 0 0L 異亮氨酸95 . 0 0酚紅282 0 . 0 0L 羥脯氨酸81 . 0 0還原谷胱甘肽271 5 . 0 0L 組氨酸72 0 0 0 . 0 0葡萄糖261 0 . 0 0甘氨酸66 0 0 0 . 0 0氯化鈉252 0 . 0 0L 谷氨酸54 0 0 . 0 0氯化鉀246 5 . 1 5L 胱氨酸二鹽酸鹽46 7 6 . 1 3無水磷酸二氫鈉232 0 . 0 0L 門冬氨酸34 8 . 8 4無水硫酸鎂225 0 . 0 0L 門冬酰胺21 0 0 . 0 0硝酸鈣212 9 0 . 0 0L 精氨酸1含量 ( mg / L )化合物名稱序號含量 ( mg / L )化合物名稱序號對氨基苯甲酸維生素纈氨酸鹽酸硫胺素酪氨酸核黃素色氨酸鹽酸吡哆醇蘇氨酸氯化膽堿絲氨酸煙酰胺脯氨酸肌醇苯丙氨酸葉酸甲硫氨酸泛酸鈣賴氨酸鹽酸鹽生物素亮氨酸谷氨酰胺異亮氨酸酚紅羥脯氨酸還原谷胱甘肽組氨酸葡萄糖甘氨酸氯化鈉谷氨酸氯化鉀胱氨酸二鹽酸鹽無水磷酸二氫鈉門冬氨酸無水硫酸鎂門冬酰胺硝酸鈣精氨酸含量化合物名稱序號含量化合物名稱序號RPMI1640 細胞培養(yǎng)基成分 （配制時添加碳酸氫鈉 2022mg/L） 五、動物細胞大規(guī)模培養(yǎng) 培養(yǎng)方式分為： ? 分批式 ? 流加式 ? 半連續(xù)式 ? 連續(xù)式 分批式培養(yǎng) 分批式培養(yǎng)：指先將細胞和培養(yǎng)液一次性裝入反應器內(nèi)進行培養(yǎng)，細胞不斷生長，產(chǎn)物不斷形成，經(jīng)一段時間后，終止培養(yǎng)。 正常培養(yǎng)的細胞周期 生長曲線 潛伏期 指數(shù)增長期 平衡期 衰退期 所謂細胞的 “ 一代 ” 是指從細胞接種到分離再培養(yǎng)的一段時間。 成纖維細胞型 游走細胞型 外形不規(guī)則且不斷變化 ，細胞內(nèi)容易出現(xiàn)暗的 吞噬性顆粒 。 密度抑制 細胞培養(yǎng)過程中， 細胞密度增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多， 細胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響而導致的細胞分裂和生長停止 。 接觸抑制 密度抑制 貼附生長 貼附生長 粘附型細胞 :附著在某一固相支持物表面才能生長的細胞。 細胞系和細胞株 初次培養(yǎng)的細胞經(jīng)第一次傳代成功后，即稱之為 細胞系 。 1997年 2月，英國科學家 Wilmut等報道了世界第一只 克隆羊 的誕生。 1975年，免疫學家 Kohler和 Milstein利用小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合，選擇到能分泌 單一抗體的雜種細胞 。 1940年， Earle建立了 小鼠的結(jié)締組織細胞系 － L系。據(jù)此，他認為 多核細胞是由單個細胞彼此融合而形成的 。 缺點是構(gòu)建膜反應器的成本較高。