【正文】 那些含有被轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的細(xì)胞才能生存并生長(zhǎng)增殖。從而可以篩選出哪個(gè)克隆含有質(zhì)粒。 JM109菌株為受體細(xì)胞，受體菌使其處于感受態(tài)，然后與pUC18質(zhì)粒共保溫實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。將經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化后的全部受體細(xì)胞進(jìn)行適當(dāng)稀釋，在含有氨卞青霉素的平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，只有轉(zhuǎn)化體才能存活，化的受體細(xì)胞則因無(wú)抵抗氨卞青霉素的能力而死亡。轉(zhuǎn)化子經(jīng)過(guò)擴(kuò)增后，可將轉(zhuǎn)入的質(zhì)粒DNA分離提取出來(lái)，用于電泳分析、限制性內(nèi)切酶圖譜的制作以及二、儀器及試劑：恒溫?fù)u床、電熱恒溫培養(yǎng)箱、電熱恒溫水浴鍋、超凈工作臺(tái)、分光光度計(jì)、高速冷凍離心機(jī)、臺(tái)式離心機(jī)。 JM109受體菌、質(zhì)粒pUC18。：LB培養(yǎng)液（1L）：胰蛋白胨10g酵母粉5gNaCl10g（高鹽）或氨芐青霉素（Ampicillin）100mg/ml用CaCl2處理而未有轉(zhuǎn)DNA測(cè)序等實(shí)驗(yàn)。5g（低鹽）在三角瓶中將胰蛋白胨 10g，酵母粉 5g以及 NaCl 5g溶于1L的重蒸水中并高壓滅菌。待冷卻至55℃， 100mg/ml 的氨芐青霉素。然后貯存于4℃?zhèn)溆?。LB平板培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g酵母粉5gNaCl10g瓊脂13g在三角瓶中依次將上述配方加入1L的重蒸水中并高壓滅菌。待培養(yǎng)基降溫至養(yǎng)基并輕輕旋轉(zhuǎn)以使溶解的瓊脂均勻分布于整個(gè)培養(yǎng)基溶液中，根據(jù)需要加入氨芐青霉素，然后可直接從三角瓶中倒出培養(yǎng)基鋪制平板。90mm直徑的培養(yǎng)皿約需培養(yǎng)基完全凝結(jié)后，倒置平皿并貯存于4℃?zhèn)溆?。其它試劑?CaCl2溶液、滅菌蒸餾水三、操作步驟：（1） JM109菌平板上挑取一單克隆菌落，培養(yǎng)基的試管中中，37℃ 220 rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜（12～16h）。（2） ml過(guò)夜菌液接種到裝有50ml LB液體培養(yǎng)基三角瓶中中，振蕩培養(yǎng)2－3h，隔20－30min測(cè)量OD600值， 離心管中，每管1ml菌液，按需要決定管數(shù)。（3）4℃，12000 rpm，離心2 min，以回收細(xì)菌。（4）倒凈上清液，倒置離心管于濾紙上1min，使殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。，冰浴30 min。（5）4℃，12000 rpm，2 min。（6）倒凈上清液，倒置離心管1min，使殘留液流盡。每管加CaCl2重新懸浮細(xì)胞（重懸時(shí)操作要輕），即成感受態(tài)細(xì)胞懸浮液。：（1）取3只滅菌的Ep管，分別編號(hào)分別加入以下各組分：加入5g。無(wú)菌條件下將細(xì)菌100 ul冰預(yù)冷的 50℃，取出培50ml培養(yǎng)基。5ml LB液體37℃，220 mol/L 10～20ng或 ～ 質(zhì)粒DNA（體積小于10ul），同時(shí)做兩個(gè)對(duì)照組：1號(hào)：受體菌對(duì)照組：100ul感受態(tài)細(xì)胞懸浮液+2ul無(wú)菌ddH2O2號(hào)：質(zhì)粒DNA對(duì)照組：100ul +2ul pUC193號(hào)：正常轉(zhuǎn)化組：100ul感受態(tài)細(xì)胞懸浮液+2ul pUC19（2）輕輕旋轉(zhuǎn)離心管以混勻內(nèi)容物，冰浴30min，促進(jìn)DNA分子在感受態(tài)細(xì)胞表面的吸附。（3）轉(zhuǎn)入便于DNA分子的吸附進(jìn)入，提高轉(zhuǎn)化率。（4）迅速轉(zhuǎn)入冰上冷卻（5）使受體菌恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)，并且表達(dá)（6）取200ul37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)可將之置于37℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，100ul左右，用移液器吹打重懸，再全部涂于含（7）觀察并記錄轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)的數(shù)目，計(jì)算轉(zhuǎn)化率。四、注意事項(xiàng)：，以防止雜菌和外源，溶液移取、分裝等均應(yīng)在無(wú)菌超凈工作臺(tái)上進(jìn)行。，以檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中是否有污染。，42℃水浴2min，通過(guò)熱刺激增強(qiáng)CaCL2的作用，2min，修復(fù)細(xì)胞膜。600u無(wú)抗生素lLB液體培養(yǎng)基，搖勻后于37℃，Ampicillin抗性基因。Ampicillin的LB平板，將平板置于無(wú)菌臺(tái)直至液體被吸收，12－16h后觀察結(jié)果，其余保存于4℃。如果平板上沒(méi)有長(zhǎng)出菌落，同時(shí)將剩下的500ul菌液離心，Ampicillin的LB平板上，置 DNA。26使細(xì)胞膜產(chǎn)生通道，220 rpm，振蕩倒掉大部分上清，37℃培養(yǎng)。60min。留 加菌液涂在含 的污染。實(shí)驗(yàn)六動(dòng)物組織細(xì)胞基因組一、實(shí)驗(yàn)原理真核生物的一切有核細(xì)胞（包括培養(yǎng)細(xì)胞）都能用來(lái)制備基因組的DNA是以染色體的形式存在于細(xì)胞核內(nèi)，質(zhì)、脂類和糖類等分離，又要保持組織細(xì)胞在含仿/異戊醇抽提分離蛋白質(zhì)，得到的蛋白酶K在勻漿后提取EDTA則抑制細(xì)胞中分子完整地分離出來(lái)。二、儀器及試劑、臺(tái)式離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)（離心管（滅菌）SDS（十二烷基硫酸鈉）和蛋白酶DNA的反應(yīng)體系中，Dnase、吸頭（滅菌）DNA提取 因此，制備DNA分子的完整。提取KDNA溶液經(jīng)乙醇沉淀使SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）存在下保持很高的活性。SDS可破壞細(xì)胞膜、活性；而蛋白酶K可將 27DNA的原則是既要將DNADNA核膜，并使組織蛋白與蛋白質(zhì)降解成小肽或氨基酸，GeneQuant）DNA。真核生物DNA與蛋白 DNA分離，使DNA 的一般過(guò)程是將分散好的的溶液中消化分解蛋白質(zhì)，再用酚和氯從溶液中析出。的重要特性是能在的 儀器：、移液器、玻璃勻漿器、：（1）細(xì)胞裂解緩沖液：Tris()mmol/LEDTA(pH )500 mmol/LNaCLmmol/LSDS10%胰RNA酶20ug/ml（2）蛋白酶K：稱取20mg蛋白酶k溶于1ml滅菌的雙蒸水中，?C20℃?zhèn)溆?。?）TE緩沖液（pH ）：高壓滅菌，室溫貯存。（4）酚?氯仿?異戊醇（25:24:1）、（5）異丙醇、冷無(wú)水乙醇、70%乙醇、滅菌水。三、操作步驟（），盡量剪碎。置于玻璃勻漿器中，加入1ml的細(xì)胞裂解緩沖液勻漿至不見組織塊， 離心管中，加入蛋白酶K（500ug/ml）20μl，混勻。在65℃恒溫水浴鍋中水浴30min，也可轉(zhuǎn)入37℃水浴12～24h，間歇振蕩離心管數(shù)次。于臺(tái)式離心機(jī)以12000 rpm離心5min，取上清液入另一離心管中。，倒轉(zhuǎn)混勻后，可以看見絲狀物，用100ul 吸頭挑出，涼干，用200ul TE 重新溶解。（可進(jìn)行PCR反應(yīng)等，需要進(jìn)一步純化的按下列步驟進(jìn)行）?氯仿?異戊醇振蕩混勻，離心12000 rpm，5min。，加入等體積的氯仿?異戊醇，振蕩混勻，離心12000 rpm，5min。，加入1/，混勻后室溫沉淀2min，離心12000 rpm ,10min。，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉。 70%乙醇洗滌沉淀物1次，離心12000 rpm，5min。，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉，室溫干燥。 TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或?C20℃保存?zhèn)溆?。四、常見?wèn)題，處理時(shí)間不易過(guò)長(zhǎng)。，細(xì)胞必須均勻分散，以減少：不純，含雜質(zhì)較多；加溶解液太少使?jié)舛冗^(guò)大。沉淀物太干燥，也將使溶解變得很困難。：操作不慎；污染核酸酶等。，其上清液太黏不易吸?。汉邼舛鹊牡牧炕驕p少所取組織的量。A280/%，并重復(fù)步驟 DNA團(tuán)塊形成。；不純，含有蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。在這種情況下，2～8。DNA，可加大抽提前緩沖液29的小于實(shí)驗(yàn)七DNA的定量一、實(shí)驗(yàn)原理核酸分子（DNA或RNA）由于含有嘌吟環(huán)和嘧啶環(huán)的共軛雙鍵，在260 nm的紫外吸收峰，其吸收強(qiáng)度與核酸的濃度成正比，這個(gè)物理特性為測(cè)定核酸溶液濃度提供了基礎(chǔ)。OD260相當(dāng)于dsDNA 50 ug/ml，ssDNA 33 ug/ml和ssRNA 40 ug/ml?？梢源藖?lái)計(jì)算核酸樣品的濃度。紫外分光光度法不但能確定核酸的濃度，還可通過(guò)測(cè)定260nm和280nm的紫外線吸收值的比值（A260/A280）估計(jì)核酸的純度，,則可能有RNA污染。對(duì)于很稀的核酸溶液，可用熒光光度法進(jìn)行測(cè)定。DNA 本身并不產(chǎn)生熒光，但在熒光染料溴化乙錠（EB）插入DNA 的堿基對(duì)平面之間并與之結(jié)合后，DNA樣品能在紫外光的激發(fā)下產(chǎn)生桔紅色熒光。熒光強(qiáng)度與被結(jié)合的EB的量成正比，而被結(jié)合的EB的量又與核酸分子長(zhǎng)度和含量成正比，使用一系列已知的不同濃度DNA溶液作標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，可比較出被測(cè)DNA溶液的濃度。靈敏度可達(dá)1～5ng。由于是基于目測(cè)，所以是估計(jì)水平。簡(jiǎn)便，但準(zhǔn)確性較低。二、儀器及試劑：AmershamGeneQantTM Pro 紫外可見分光光度儀，瓊脂糖凝膠電泳設(shè)備。：5上樣緩沖液：配制10 ml, 波長(zhǎng)處有特異若 該方法經(jīng)濟(jì) mol/L EDTA()ml10% SDSul50% 甘油 ml% 溴酚藍(lán)mg% 二甲苯青FFmg加去離子水至10 ml其它試劑：TE、DNA標(biāo)準(zhǔn)液，EB儲(chǔ)存液（10 mg/ml），三、實(shí)驗(yàn)步驟（1）TE對(duì)待測(cè)DNA樣品按1:20或合適的倍數(shù)稀釋。（2）開機(jī)，儀器會(huì)自動(dòng)對(duì)光路及分析軟件進(jìn)行檢測(cè)，待顯示屏上出現(xiàn)“instrument Ready”時(shí)，進(jìn)入核酸測(cè)定窗口（3）調(diào)零。TE緩沖液注入樣品杯，放入樣品槽，關(guān)閉蓋板。點(diǎn)擊“set ref”鍵，儀器自動(dòng)校正零點(diǎn)。將樣品槽內(nèi)的樣品杯取出，換上待測(cè)樣品。（4）吸70 ul已稀釋的DNA樣品轉(zhuǎn)入石英樣品杯，放入樣品槽，關(guān)閉蓋板。如果樣品很少，可以用5～7ul的石英樣品杯。點(diǎn)擊“enter” 鍵，儀器即進(jìn)入分析狀態(tài)。窗口同時(shí)顯示260和280nm處的光密度（OD值）及260/280nm和280/260nm的比率以及DNA樣品的濃度等。（5）打開蓋板，取出石英樣品杯，吸出樣液，用高純水清潔石英樣品杯，風(fēng)干后，再加入下一個(gè)待測(cè)樣品。（6）DNA純度：以O(shè)D260/ OD280比值來(lái)反映。當(dāng)OD60 /OD80比值 ，說(shuō)明樣品存在RNA污染，可以用RNA酶處理樣品去處RNA。（1）瓊脂糖凝膠的制備。（2）樣品的準(zhǔn)備。把待測(cè)DNA樣品進(jìn)行1:2連續(xù)稀釋，并準(zhǔn)備一份DNA標(biāo)準(zhǔn)液作對(duì)照。（3）上樣。稀釋樣品與上樣緩沖液按1:5混合均勻后上樣。（4）電泳。用100V穩(wěn)壓電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移到凝膠的3/4處停止電泳。（5）取出凝膠，入EB熒光染液中作用20min，取出后清水漂洗干凈，然后紫外檢測(cè)。肉眼可見到的最高稀釋度約含DNA 80ng。此法也可用于了解核酸樣品中的嚴(yán)重污染干擾核酸紫外線吸收物質(zhì)的情況。四、常見問(wèn)題1． 紫外分光光度法不能區(qū)分三種構(gòu)型，也不能區(qū)分染色體染色體DNA、以及偏高。2．OD320值是背景，若溶液鹽濃度越高，3．的光面以避免干擾測(cè)定。DNADNA和DNA解鏈的增色效應(yīng)等因素的影響，因此測(cè)得的數(shù)據(jù)往往比實(shí)際濃度 RNA等。由于測(cè)定吸收光度OD320也越高。要小心不要摔破，32DNA分子的超螺旋、開環(huán)、線狀A(yù)260時(shí)，難以排除 持杯時(shí)也不要接觸透明RNA、分子的構(gòu)型，如質(zhì)粒測(cè)樣品時(shí)使用的石英樣品杯比較貴，實(shí)驗(yàn)八PCR基因擴(kuò)增一、實(shí)驗(yàn)原理聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一種體外核酸擴(kuò)增系統(tǒng)，其原理類似DNA分子的天然復(fù)制過(guò)程，是將在待擴(kuò)增的DNA片段和與其兩側(cè)互補(bǔ)的兩個(gè)寡聚核苷酸引物，經(jīng)變性、退火和延伸若干個(gè)循環(huán)后，生物學(xué)中一種有助于DNA克隆及基因分析的必需工具。PCR的工作程序?qū)嶋H上是一個(gè)在模板種脫氧核苷酸等存在的情況下，DNA聚合酶依賴的酶促合成反應(yīng)。擴(kuò)增的特異性取決于引物與模板DNA的結(jié)合。整個(gè)擴(kuò)增過(guò)程分三步：①變性，加熱使模板裂而形成兩條單鏈；②退火，突然降低溫度后模板存在兩條模板鏈之間的結(jié)合，但由于引物的高濃度、物與模板之間；③延伸，在DNA聚合酶及鎂離子等的存在條件下，從引物的結(jié)合單核苷酸，形成與模板鏈互補(bǔ)的新的循環(huán)，樣本中的DNA量就增加一倍，新形成的40個(gè)循環(huán)后，DNA 可擴(kuò)增106～109倍。二、儀器及試劑：PCR儀、臺(tái)式離心機(jī)、移液器及吸頭、：10X PCR 緩沖液配制（部分隨Taq250～500 mmol/L100～500 mmol/L15～20 mmol/L%1mg/L其它試劑：模板DNA、dNTP 混合液、凝膠、等DNA擴(kuò)增 DNA、一對(duì)已知序列的寡核苷酸引物和四DNA引物按堿基配對(duì)原則互補(bǔ)結(jié)合，也結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，DNA鏈。完成以上三步為一個(gè)循環(huán)，每經(jīng)過(guò)一個(gè)DNA鏈又成為下一輪循環(huán)的模板。現(xiàn)用圖示說(shuō)明PCRPCR薄壁管、電泳儀等： KCl TrisCl（）MgCl2Tween20BSA Taq聚合酶、上游和下游寡核苷酸引物、瓊脂糖332n 倍。該技術(shù)已成為分子DNA主要的結(jié)合發(fā)生在引: 3 ′端開始，經(jīng)過(guò)25～ 雙鏈間的氫鍵斷 原理酶提供）三、操作步驟 體系（40ul）：4ul10XPCR 緩沖液4ul25mM MgCl2（根據(jù)不同公司PCR 緩沖液的不同而定）Xul模板DNA ≥50ng1ul上游引物（50100ng）1ul下游引物（50100ng）1uldNTP Mixture（終濃度 ulTaq聚合酶加ddH2O至40ul視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。加樣后用手輕彈混勻，使反應(yīng)成分集于管底。：（1）95℃300s變性（2）94℃45s變性（3）55℃45s退火（根據(jù)不同引物可能有不同退火溫度）（4）72℃45s延伸（每分鐘可延伸重復(fù)步驟24共 30 循環(huán)（5）72℃600s延伸反應(yīng)結(jié)束后短暫離心，吸取少量（10ul）進(jìn)行分析，其余置4℃保存?zhèn)溆谩?0－200uM）1kp）6000 rpm 15 sec離心四、注意事項(xiàng)： 體系所加成分的實(shí)際用量應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)者選用的該成分的終濃度及所擁有的貯備液濃度進(jìn)行核算。,吸頭垂直進(jìn)入試劑管，每加完一樣要換一個(gè)吸頭，同時(shí)在已加的樣品前做個(gè)記號(hào)以防止錯(cuò)加或漏加，避免污染。（置于冰盒上）應(yīng)最后加入，盡量減少室溫接觸機(jī)會(huì)。加酶時(shí)吸頭深入不可過(guò)深，酶量不能過(guò)多。五、影響PCR的主要因素單鏈、雙鏈DNA白水解酶等的污染。模板用量依具體實(shí)驗(yàn)而定，PCR反應(yīng)時(shí)模板變性要充分。