【導讀】體已經發(fā)表或撰寫過的作品成果。對本文的研究做出重要貢獻的個人。和集體均已在文中以明確方式標明。本人完全意識到本聲明的法律結。探索喜樹葉黃酮提取有哪些影響因素？裝置科學合理，可行性，有代表性。采用的響應面分析是優(yōu)越的分析法，要求嚴謹，綜合分析。在分析影響因素時要有實例支持，歸納論點時要有理有據(jù)。案、分析解決實驗中出現(xiàn)的問題以及實驗資料和數(shù)據(jù)的分析處理能力。20xx年9月下旬，初步構思，摘取實驗材料喜樹葉。20xx年11月中旬，進一步查閱有關文獻資料，完善實驗方案。20xx年4月至5月，撰寫論文，準備答辯。主要分布于我國長江流域及以南地區(qū)，為我國闊葉樹中的珍品之一，具有很高的觀。生物多具黃色，故又稱黃堿素或黃酮。黃酮類化合物在植物體中通常與糖結合成苷類，小。絕大多數(shù)植物體內都含有黃酮類化合物，它在植物的。位，主要集中在花、葉、果實中，有研究指出，喜樹葉中黃酮類化合物含量豐富。

　　

【正文】 ............................................ 23 I 響應面設計優(yōu)化喜樹葉黃酮提取工藝 摘 要 研究顯示，喜樹葉中黃酮類化合物含量相對豐富。為提高喜樹葉中黃酮類化合物的提取效率，本論文在以風干喜樹葉為原料 , 用乙醇作提取劑，在喜樹葉的黃酮提取工藝中 , 將單因素試驗和響應面實驗設計分析法應用于回流提取喜樹葉黃酮工藝 , 研究回流提取的條件及其對提取結果即黃酮的得率的影響，尋求各因素的綜合優(yōu)化條件。本實驗首先對可能影響喜樹葉黃酮提取的五個因素：料液比，提取次數(shù)，乙醇體積分數(shù)，提取溫度，每次提取時間進行單因素試驗，結果可以 找 出各因素與提取率的大致關系，并 選 擇 了三個顯著影響因素即料液比，乙醇體積分數(shù)，提取溫度 ， 以提取率為響應值，進行了經典的三因素三水平BoxBenhnken 試驗設計，并通過 DesignExpert 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，得到相關響應面數(shù)據(jù)和分析結果。結果表明，乙醇回流提取喜樹葉黃酮的最佳工藝條件為 1:40 料液比 ， 60%乙醇，溫度 80℃ ，每次提取 90 min，提取三次。這些結論為提高喜樹葉黃酮利用率及其工業(yè)化生產提供了一定的理論參考。 【關鍵詞】 響應面法 ； 喜樹葉 ； 黃酮提取 II Optimization of Extraction Process of Flavonoids from Camptotheca acuminata leaves Using Response Surface Methodology Abstract Studies have shown that the content of flavonoids in Camptotheca acuminata leaves is relatively abundant. In order to improve the extraction efficiency of flavonoids in Camptotheca acuminata leaves, studies of the paper used airdry Camptotheca acuminata leaves as raw material, ethanol as extraction agent. In this extraction process, the single factor experiment and response surface experimental design analysis method were applied to reflux extraction, to research reflux extraction conditions and their impact on the yield of flavonoids extraction results, and seek the optimal conditions. The single factor experiments first had five factors that may affect the yield of flavonoids extraction: solidliquid ratio, extraction times, ethanol concentration, extraction temperature and extraction time and the results had shown that the approximate relationship of the various factors and extraction rate, and three significant factors: solidliquid ratio, ethanol volume fraction, extraction temperature. Then the classic three factors and three levels BoxBenhnken experimental design was carried out to establish a quadratic regression model for the extraction efficiency of total flavonoids, and analysis of the experimental data was processed by the DesignExpert software. The optimal conditions of ethanol extract for flavonoids in Camptotheca acuminata leaves were obtained as follows: solidliquid ratio1:40, ethanol volume fraction 60%, extraction temperature 80 176。C , extraction time 90min each time and extraction times three times. These conclusions can provide some theoretical reference for improvement of the utilization of Camptotheca flavonoids and their industrial production. [keywords] response surface methodology。 camptotheca acuminata leaves。 extraction of flavonoids 1 第 1 章 緒論 喜樹 喜樹 (Camptotheca acuminata Dee)屬紫樹科 (Nyssaeeae)，別名旱蓮木，是我國特有樹種之一，主要分布于我國長江流域及以南地區(qū)，為我國闊葉樹中的珍品之一，具有很高的觀賞價值，是綠化、美化環(huán)境的優(yōu)良綠蔭樹和風景樹，同樣也是非常重要藥用樹種之一 [1]。喜樹為落葉大喬木，樹高可達 2530m；樹皮幼時呈淡灰色 ， 老則呈灰褐色；小枝幼時呈綠色，略具灰褐色絨毛，老則呈淡褐色；葉互生，卵狀長方形或卵狀橢圓形，表面深綠色，下面淡綠色；先端漸尖，基部圓或廣楔形，全緣，邊緣有纖毛，羽脈 1011 對；葉柄紅色，有疏毛；花單性同株，白色，無梗，多數(shù)排成球形頭狀化序，雌花球頂生，雄花球腋生；花期 78月，果期 1112 月，果實披針形，兩邊有翅；內有種子 1 粒，干縮成細條狀。喜樹屬深根性樹種 ，性喜溫暖，不耐嚴寒，適生于年均溫度 1317℃ 的地區(qū)。土壤以深厚、肥沃、排水良好的砂壤土生長較好，多生于海拔 1000 m以下的山腳溝谷坡地；較耐水濕，在河灘沙地、河湖堤岸以及地下水充足處生長良好 [2]。其中，湖南科技學院校園里有幾顆高大喜樹，生長旺盛。 黃酮 類化合物 活性及生理作用 黃酮類化合物（ flavonoids）是一類存在于自然界的、具有 2苯基色原酮（ flavone）結構的化合物。它們分子中有一個酮式羰基，第一位上的氧原子具堿性，能與強酸成鹽，其羥基衍生物多具黃色，故又稱黃堿素或黃酮。黃酮類 化合物在植物體中通常與糖結合成苷類，小部分以游離態(tài)（苷元）的形式存在。絕大多數(shù)植物體內都含有黃酮類化合物，它在植物的生長、發(fā)育、開花、結果以及抗菌防病等方起著重要的作用。黃酮廣泛存在于植物的各部位，主要集中在花、葉、果實中，有研究指出，喜樹葉中黃酮類化合物含量豐富。大量研究顯示，黃酮類化合物有強大的生理活性和藥用價值，具有抗腫瘤、護肝、抗炎、抗菌、抗病毒、調節(jié)內分泌系統(tǒng)等諸多功效，同時還能抑制脂質過氧化作用、血小板凝集、毛細管滲透性以及脆性等 [35]。此外，黃酮在食品中的應用也很廣，它在食品中主要用于天然 甜味劑、天然抗氧化劑、天然色素、保健食品等方面 [47]。 2 國內外研究現(xiàn)狀 近些年來國內，從中草藥中提取分 離黃酮類化 合 物的工作開得較為廣泛。已有 從黃芩、水芹、銀杏葉、竹葉、龍柏葉、 楮樹葉 中提取分離了許多黃酮類化合物 [4]。但目前對喜樹的開發(fā)利用僅限于提取抗癌藥物喜樹堿，其資源沒有得到充分利用，特別對葉子的開發(fā)利用相對較少 [7]。從喜 樹中提取總黃酮的研究也鮮見報道。王學利得到水提取喜樹葉總黃酮的最優(yōu)提取方案：以 pH 值 10 的水為溶劑，提取溫度 91100℃ ，溶劑體積 5060 mL，提取時間 2537 min，可最大限度地提取喜樹葉中的黃酮 [4]。毛燕等研究了不同條件對水提取喜樹翅果總黃酮含量提取的影響，發(fā)現(xiàn)最佳提取條件為：溶劑體積 40 mL，提取時間 60 min，提取溫度 90100℃ ，總黃酮含量最高為 ％ [6]。楊國恩等得到超聲 微波協(xié)同輔助溶劑法提取喜樹 果 總黃酮提取的優(yōu)化工藝：提取時間 48 min，提取溶劑中乙醇體積分數(shù) 70％，料液比 1g:6mL，優(yōu)化工藝條件下總黃酮的產率可達 %[6]。喜樹總黃酮含量最高的部位是果實，其次是葉和根，最低為莖。喜樹的果實和葉中總黃酮的提取效率較高， 且 容易大規(guī)模 采集果實和葉片 (不會危及樹木的生命 )，再加上喜樹近年的大力推廣及蘊涵的較大 經濟效益，因此，提取喜樹葉總黃酮具有一定的研究價值 [6]。國內有研究涉及喜樹葉黃酮提取的索氏提取法，水提取法，微波提取法等，還有正交實驗研究黃酮的提取，但對于響應面的應用在這個方面還沒有涉及 [711]。 響應面設計分析方法 響應面分析法 ( Response Surface Methodology, RSM) , 將數(shù)學與統(tǒng)計學相結合 , 采用多元二次回歸方法作為函數(shù)估計的工具來擬合因素與響應值之間的函數(shù)關系 , 依此可對函數(shù)的響應面和等高線進行分析來尋求最佳工藝參數(shù)。相對于正交設計，響應面設計試驗次數(shù)少、周期短，求得的同歸方程精度高，是一種能研究幾種因素間交互作用的回歸分析方法 [1217]。 一般的試驗設計與優(yōu)化方法，都未能給出直觀的圖形，因而也不能憑直覺觀察其最優(yōu)化點，雖然能找出最優(yōu)值，但難以直觀地判別優(yōu)化區(qū)域。為此響應面分析法（也稱響應曲面法）應運而生。 響應面法的基本思想是通過近似構造一個具有明確表達形式的多項式來表達隱式功能函數(shù)。本質上來說，響應面法是一套統(tǒng)計方法 ,用這種方法來尋找考慮了輸入變量值的變異或 不確定性之后的最佳響應值 [12]。響應面分析也是一種最優(yōu)化方法，它是將體系的響應（如萃取化學中的萃取率）作為一個或多個因素（如萃取劑濃度、酸度等）的函數(shù)，運用圖形技術將這種函數(shù)關系顯示出來，以 3 供我們憑借直覺的觀察來選擇試驗設計中的最優(yōu)化條件。 顯然，要構造這樣的響應面并進行分析以確定最優(yōu)條件或尋找最優(yōu)區(qū)域，首先必須通過大量的量測試驗數(shù)據(jù)建立一個合適的數(shù)學模型（ 建模 ），然后再用此數(shù)學模型作圖。 建模最常用和最有效的方法之一就是 多元線性回歸 方法 [12]。對于非線性體系可作適當處理化為線性形式。 中心復合設計仍然是當前應用得最多的 RSM 經典設計方法 [12]。 化學和生物學領域是 RSM 最重要的應用領域， RSM 在這兩個學科的研究中充分展現(xiàn)了它的優(yōu)點 [12]。 實驗研究方法 本論文首創(chuàng)性地對喜樹葉進行響應面設計優(yōu)化黃酮提取工藝，對開發(fā)喜樹葉資源具有一定的研究價值和現(xiàn)實意義。本論文以風干喜樹葉為原料，在喜樹葉的黃酮提取研究中，將單因素和響應面分析法應用于乙醇回流提取喜樹葉黃酮工藝，研究回流提取的條件及 其對提取結果即黃酮的得率的影響，尋求各因素的綜合優(yōu)化條件，為提高喜樹葉黃酮利用率以及為工業(yè)化生產提供一定的理論參考。 4 第 2 章 材料與方法 黃酮類化合物含量測定的原理 黃酮類化合物易溶于熱水和熱的乙醇，用石油醚處理過的樣品，用乙醇溶液回流提取，得到黃酮提取液 [5]。 在中性或弱堿性及亞硝酸鈉存在條件下，黃酮類化合物與鋁鹽生成鰲合物，加入氫氧化鈉溶液后顯紅橙色， 是因為 亞硝酸鈉還原黃酮，加硝酸鋁絡合，加氫氧化鈉使黃酮類 化合物開環(huán)，生成 2’OH 查耳酮而顯色。在波長 510 nm附近有吸收，可用分光光度法進行測定 [5]。 利用黃酮類化合物中的 3羥基、 4羥基、 5羥基、 4羰基或鄰二位酚羥基，與 Al3＋ 進行絡合反應，在堿性條件下生成紅色絡合物的原理測定其含量。 材料、藥品試劑及儀器 實驗材料 實驗原材料為喜樹葉， 20xx 年 9 月下旬采摘于湖南科技學院校園，挑選新鮮干凈喜樹葉采摘后，經清洗，烘干，室溫保存于實驗室備用。 主要藥品與試劑 蘆丁標準品、 95%乙醇、石油醚、亞硝酸鈉、三氯化鋁、氫氧化鈉。藥品試劑均達分析純。 主要儀器與器具 T6可見分光光度計、 TE124S 電子天平、 RE52B 旋轉蒸發(fā)儀、烘箱、回流提取裝置、 DF101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器、燒杯，容量瓶，移液管，移液槍，量筒，比色管等。 5 實驗方法 與步驟 樣品處理 將葉片剪成適當長度，再在 105℃ 烘至恒重。采用 Soxhlet 提取法，以沸程為 30℃ 60℃ 的石油醚為脫脂劑于 45℃ 水浴中脫脂 3 次每次 2 小時，充分除去樣品 中脂類和脂溶性色素。取出樣品，先置通風處晾干，再將濾紙包