動(dòng)物組織與胚胎工程(2)-資料下載頁(yè)
2024-09-20 20:41本頁(yè)面
【正文】 的作用使之聚合。當(dāng)用兩個(gè)無(wú)透明帶胚胎時(shí)，以類似 “ 三明治 ” 的方式，把細(xì)胞放到兩個(gè)胚胎之間，使之聚合。 第三種利用兩種細(xì)胞間聚合。聚合時(shí)，各取數(shù)個(gè)細(xì)胞或卵裂球，放入空透明帶內(nèi)，用 PHA使之聚合在一起，并用瓊脂包埋。通過(guò)中間受體培養(yǎng)一段時(shí)間后，觀察其發(fā)育的情況。 囊胚注射法 把某些種類細(xì)胞注射入囊胚的囊胚腔中，注射的細(xì)胞可以是卵裂球、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞，甚至是已經(jīng)分化的細(xì)胞。若注入的細(xì)胞參與胚體的形成，那么就形成了嵌合體。注射時(shí)，選取健康、生長(zhǎng)良好的細(xì)胞。如果是培養(yǎng)細(xì)胞，應(yīng)該保證其整二倍體性。將 10－ 12個(gè)細(xì)胞吸入到注射吸管的頂端。用固定吸管吸住內(nèi)細(xì)胞團(tuán)與滋胚層交界處，讓內(nèi)細(xì)胞團(tuán)位于囊胚的底部位置。調(diào)整注射吸管與固定吸管使處于同一焦點(diǎn)平面，選擇滋胚層細(xì)胞間的 “ 間隙處 ” ，將注射吸管插入囊胚腔。將細(xì)胞推入囊胚腔，使之落到內(nèi)細(xì)胞團(tuán)之上。操作后的囊胚形態(tài)不規(guī)則，經(jīng)短期培養(yǎng)后，可以恢復(fù)正常狀態(tài)。 有色鼠與白色鼠胚胎融合 胚胎 嵌合 的鑒定 兩種：色素分析法和遺傳分析法 色素分析法簡(jiǎn)單、直觀，比較實(shí)用。一般選用膚色、毛色差異明顯的動(dòng)物的胚胎作為供體胚，如用白鼠或黑鼠。幼鼠生下 4－5天后，就可以分析其膚色或毛色，懷孕 10天左右的小鼠胎兒，眼睛就有色素沉積。或者在出生時(shí)，檢查眼瞼色素情況，確定是否是嵌合體。 使用同工酶分析 ? 首先分析動(dòng)物特定的同工酶譜系，然后選擇具有不同圖譜的兩種或多種動(dòng)物作為供體動(dòng)物提供胚胎。 ? 如果獲得的動(dòng)物是嵌合體，那么同工酶譜中應(yīng)顯現(xiàn)與供體動(dòng)物相對(duì)應(yīng)的特定譜帶，不同品種動(dòng)物的同工酶均有表現(xiàn)。 ? 現(xiàn)在比較常用的是磷酸葡萄糖異構(gòu)酶（ GPI） 分析，其原理是果糖－ 6－磷酸在 GPI作用下，產(chǎn)生葡萄糖－ 6－磷酸，在 6－磷酸葡萄糖脫氫酶和 NADP作用下，使 G－ 6－ P成為 6－磷酸葡萄糖酸鹽，NADP還原為 NADPH。 經(jīng) GPI染液染色，可顯示出同工酶譜帶。 ? 分析時(shí)，從嵌合動(dòng)物中取不同組織器官，勻漿后制成電泳樣本，在醋酸纖維素板上點(diǎn)樣，電泳、染色處理。與標(biāo)準(zhǔn)的同工酶譜對(duì)照，鑒定是否是嵌合體。 胚胎嵌合的意義 胚胎嵌合技術(shù)可以作為研究分析哺乳動(dòng)物發(fā)生機(jī)制的重要手段，例如研究卵裂球分化潛力，研究性分化機(jī)制與性比，研究 X染色體失活及其作用和研究胚胎細(xì)胞基因表達(dá)的機(jī)制；也可以對(duì)生理功能分析的應(yīng)用，例如對(duì)免疫功能、遺傳病的研究分析；還可以培育雜種個(gè)體，甚至是種間雜種；可以通過(guò)制作各種組合的嵌合體，培育新的毛皮動(dòng)物；利用種間移植，分析胎兒和母體的相互關(guān)系。 三、胚胎分割 ? １、胚胎分割的原理 ? 根據(jù)卵裂球具有發(fā)育成為一個(gè)個(gè)體的全能性的特點(diǎn)，人們就考慮用這種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，生產(chǎn)同卵雙胎或多胎，以加速優(yōu)良種群的繁殖。 ? 胚胎的分割在不同時(shí)期有不同的分離培養(yǎng)方法，如卵裂球分離培養(yǎng)法、致密化前各期胚胎分割法、桑椹胚至囊胚期胚胎分割法等。 同卵雙生 ２、卵裂球分離培養(yǎng) ? 卵裂球分離培養(yǎng)是將桑椹胚以前的卵裂胚去掉透明帶，分離每個(gè)卵裂球，將其包埋于瓊脂中，將包有卵裂球的瓊脂柱，移到中間受體小鼠或兔的輸卵管中，經(jīng)數(shù)日活體內(nèi)培養(yǎng)后，再取出已經(jīng)發(fā)育到多細(xì)胞的胚胎，移于受體子宮。 ? 這種方法已經(jīng)在牛、羊、馬生出同卵多胎。 ? 對(duì)研究卵裂球位置與分化方向以及研究嵌合胚、不同卵裂球遺傳性等，都是一種很有用的技術(shù)。 ３、致密化以前各期的胚胎分割 ? 對(duì)于致密化以前各期的胚胎，由于卵裂球之間彼此尚未建立起緊密聯(lián)系，分割時(shí)較容易進(jìn)行。根據(jù)胚胎的直徑，制作適宜口徑的固定吸管和吸取卵裂球用的微吸管。在顯微操作儀上，用固定吸管固定住胚胎，然后用微玻璃針自上而下切開(kāi)透明帶，使其成為一個(gè)切口。將微吸管自切口處伸入，吸住半數(shù)卵裂球，慢慢取出，這樣即可以把胚胎一分為二。把吸出的半胚或卵裂球，納入空透明帶中?？胀该鲙菍U棄的卵母細(xì)胞或不合適的胚胎，去除其內(nèi)容物即可。然后將分割后的胚胎包入瓊脂柱，通過(guò)中間受體培養(yǎng)。依照同樣的方法，可以將胚胎分割成為四或八分胚。 ４、桑椹期的胚胎分割 ? 用微玻璃針或微刀進(jìn)行分割，無(wú)需固定吸管，由于透明帶韌性較強(qiáng)。 ? 切割之前需要對(duì)其進(jìn)行軟化處理，處理標(biāo)準(zhǔn)是： 4－ 8細(xì)胞胚胎用 ％酶液處理 1－ 2分鐘；桑椹胚用 ％－ ％酶液處理 30秒鐘；囊胚則用 ％－％酶液處理 30秒以下。 ５、過(guò)程 ? 把經(jīng)過(guò)軟化處理的胚胎，與少量培養(yǎng)液一起置于載片上，把針或微刀的刃部調(diào)節(jié)到胚胎的正上方。然后自胚胎的等分線向下移動(dòng)，把胚胎輕輕壓住，繼續(xù)下切，胚胎就被壓扁，繼而被切開(kāi)。再把切割的胚胎納入空透明帶。 ? 囊胚切割時(shí)，需將內(nèi)細(xì)胞團(tuán)一分為二，早期的囊胚的二分胚發(fā)育率，比桑椹胚的二分胚發(fā)育率要低，可能是因?yàn)槟遗哒幱谶M(jìn)一步的細(xì)胞分化狀態(tài)，操作后胚胎的調(diào)整能力比桑椹胚差。相對(duì)而言，二分胚、四分胚比較容易培養(yǎng)，而八分胚的存活率很低。 過(guò)程 胚胎分割
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