動物組織與胚胎工程(2)-資料下載頁
2025-09-11 20:41本頁面
【正文】 的作用使之聚合。當用兩個無透明帶胚胎時，以類似 “ 三明治 ” 的方式，把細胞放到兩個胚胎之間，使之聚合。 第三種利用兩種細胞間聚合。聚合時，各取數個細胞或卵裂球，放入空透明帶內，用 PHA使之聚合在一起，并用瓊脂包埋。通過中間受體培養(yǎng)一段時間后，觀察其發(fā)育的情況。 囊胚注射法 把某些種類細胞注射入囊胚的囊胚腔中，注射的細胞可以是卵裂球、內細胞團細胞、胚胎干細胞，甚至是已經分化的細胞。若注入的細胞參與胚體的形成，那么就形成了嵌合體。注射時，選取健康、生長良好的細胞。如果是培養(yǎng)細胞，應該保證其整二倍體性。將 10－ 12個細胞吸入到注射吸管的頂端。用固定吸管吸住內細胞團與滋胚層交界處，讓內細胞團位于囊胚的底部位置。調整注射吸管與固定吸管使處于同一焦點平面，選擇滋胚層細胞間的 “ 間隙處 ” ，將注射吸管插入囊胚腔。將細胞推入囊胚腔，使之落到內細胞團之上。操作后的囊胚形態(tài)不規(guī)則，經短期培養(yǎng)后，可以恢復正常狀態(tài)。 有色鼠與白色鼠胚胎融合 胚胎 嵌合 的鑒定 兩種：色素分析法和遺傳分析法 色素分析法簡單、直觀，比較實用。一般選用膚色、毛色差異明顯的動物的胚胎作為供體胚，如用白鼠或黑鼠。幼鼠生下 4－5天后，就可以分析其膚色或毛色，懷孕 10天左右的小鼠胎兒，眼睛就有色素沉積。或者在出生時，檢查眼瞼色素情況，確定是否是嵌合體。 使用同工酶分析 ? 首先分析動物特定的同工酶譜系，然后選擇具有不同圖譜的兩種或多種動物作為供體動物提供胚胎。 ? 如果獲得的動物是嵌合體，那么同工酶譜中應顯現與供體動物相對應的特定譜帶，不同品種動物的同工酶均有表現。 ? 現在比較常用的是磷酸葡萄糖異構酶（ GPI） 分析，其原理是果糖－ 6－磷酸在 GPI作用下，產生葡萄糖－ 6－磷酸，在 6－磷酸葡萄糖脫氫酶和 NADP作用下，使 G－ 6－ P成為 6－磷酸葡萄糖酸鹽，NADP還原為 NADPH。 經 GPI染液染色，可顯示出同工酶譜帶。 ? 分析時，從嵌合動物中取不同組織器官，勻漿后制成電泳樣本，在醋酸纖維素板上點樣，電泳、染色處理。與標準的同工酶譜對照，鑒定是否是嵌合體。 胚胎嵌合的意義 胚胎嵌合技術可以作為研究分析哺乳動物發(fā)生機制的重要手段，例如研究卵裂球分化潛力，研究性分化機制與性比，研究 X染色體失活及其作用和研究胚胎細胞基因表達的機制；也可以對生理功能分析的應用，例如對免疫功能、遺傳病的研究分析；還可以培育雜種個體，甚至是種間雜種；可以通過制作各種組合的嵌合體，培育新的毛皮動物；利用種間移植，分析胎兒和母體的相互關系。 三、胚胎分割 ? １、胚胎分割的原理 ? 根據卵裂球具有發(fā)育成為一個個體的全能性的特點，人們就考慮用這種實驗技術，生產同卵雙胎或多胎，以加速優(yōu)良種群的繁殖。 ? 胚胎的分割在不同時期有不同的分離培養(yǎng)方法，如卵裂球分離培養(yǎng)法、致密化前各期胚胎分割法、桑椹胚至囊胚期胚胎分割法等。 同卵雙生 ２、卵裂球分離培養(yǎng) ? 卵裂球分離培養(yǎng)是將桑椹胚以前的卵裂胚去掉透明帶，分離每個卵裂球，將其包埋于瓊脂中，將包有卵裂球的瓊脂柱，移到中間受體小鼠或兔的輸卵管中，經數日活體內培養(yǎng)后，再取出已經發(fā)育到多細胞的胚胎，移于受體子宮。 ? 這種方法已經在牛、羊、馬生出同卵多胎。 ? 對研究卵裂球位置與分化方向以及研究嵌合胚、不同卵裂球遺傳性等，都是一種很有用的技術。 ３、致密化以前各期的胚胎分割 ? 對于致密化以前各期的胚胎，由于卵裂球之間彼此尚未建立起緊密聯(lián)系，分割時較容易進行。根據胚胎的直徑，制作適宜口徑的固定吸管和吸取卵裂球用的微吸管。在顯微操作儀上，用固定吸管固定住胚胎，然后用微玻璃針自上而下切開透明帶，使其成為一個切口。將微吸管自切口處伸入，吸住半數卵裂球，慢慢取出，這樣即可以把胚胎一分為二。把吸出的半胚或卵裂球，納入空透明帶中。空透明帶是將廢棄的卵母細胞或不合適的胚胎，去除其內容物即可。然后將分割后的胚胎包入瓊脂柱，通過中間受體培養(yǎng)。依照同樣的方法，可以將胚胎分割成為四或八分胚。 ４、桑椹期的胚胎分割 ? 用微玻璃針或微刀進行分割，無需固定吸管，由于透明帶韌性較強。 ? 切割之前需要對其進行軟化處理，處理標準是： 4－ 8細胞胚胎用 ％酶液處理 1－ 2分鐘；桑椹胚用 ％－ ％酶液處理 30秒鐘；囊胚則用 ％－％酶液處理 30秒以下。 ５、過程 ? 把經過軟化處理的胚胎，與少量培養(yǎng)液一起置于載片上，把針或微刀的刃部調節(jié)到胚胎的正上方。然后自胚胎的等分線向下移動，把胚胎輕輕壓住，繼續(xù)下切，胚胎就被壓扁，繼而被切開。再把切割的胚胎納入空透明帶。 ? 囊胚切割時，需將內細胞團一分為二，早期的囊胚的二分胚發(fā)育率，比桑椹胚的二分胚發(fā)育率要低，可能是因為囊胚正處于進一步的細胞分化狀態(tài)，操作后胚胎的調整能力比桑椹胚差。相對而言，二分胚、四分胚比較容易培養(yǎng)，而八分胚的存活率很低。 過程 胚胎分割
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