廣西地方標準甘蔗梢腐病的鑒定檢測方法征求意見稿-資料下載頁
2025-08-20 18:46本頁面
【正文】 病的樣品作陰性對照；以等體積ddH2O代替模板DNA作空白對照?？瞻讓φ眨簾o目標擴增條帶。陰性對照：無目標擴增條帶。陽性對照：出現目標擴增條帶?！?結果判定如果陽性對照和檢測樣品中同時出現目的的擴增條帶，而陰性對照和空白對照均不出現該目的條帶，該樣品判斷為陽性，并根據所用的引物判定小種類型；如果陽性對照出現目的擴增條帶，而陰性對照、空白對照及檢測樣品中均不出現該條帶，則該樣品判斷為陰性；如果空白、陰性對照出現該目的條帶，或陽性對照未出現目的條帶，應該重新檢測?！?TaqMan熒光定量PCR檢測技術此法檢測要求：真菌的DNA濃度介于1 ng/μl至1000 ng/μl是TaqMan探針檢測的最佳濃度，此法適合對病原菌分離純化并提取的DNA以及對病葉組織提取的DNA進行檢測?！?qPCR引物和探針gx1的qRTPCR引物和探針：FAMgx1AS4: CTGTTCGAGCGTCATTTCAACFAMgx1P4: CGCGAGTCCCAACACCAAGCFAMgx1R4：GACGATTACCAGTAACGAGGGgx2的qRTPCR引物和探針：FAMgx2AS6：TCATTTCAACCCTCAAGCCCFAMgx2P6：CGCCGATCCCCAACACCAAACFAMgx2R6：GAGACCGCCACTAGATTTCG qPCR反應操作技術每個測試樣本qPCR體系為：總體積為20 μL，其中上下游探針引物(FAMgx1AS4/FAMgx1R4 或 FAMgx2AS6/FAMgx2R6)500 nM，探針(FAMgx1P4或FAMgx2P6) 250 nM，Premix LA Taq 10 μL，模板DNA（）1 μL，用ddH2O補足，置于Roche 480熒光定量PCR系統(tǒng)運行分析，在每個循環(huán)的延伸結束時進行熒光信號檢測，熒光模式設為FAM。反應程序為： 95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)?！?對照結果檢測過程中分別設陽性對照、陰性對照和空白對照。用已知含甘蔗梢腐病的樣品或梢腐病菌DNA作陽性對照；用已知不含甘蔗梢腐病的樣品作陰性對照；以等體積ddH2O代替模板作空白對照?？瞻讓φ眨簾oCt值且無擴增曲線。陰性對照：無Ct值且無擴增曲線。陽性對照：Ct值≤，并出現典型的擴增曲線。否則，此次試驗視為無效?！?結果判定陰性:無Ct值且無擴增曲線，表明樣品中不含甘蔗梢腐病菌。陽性：Ct≤，表明樣品中含甘蔗梢腐病菌，并且根據使用的引物和探針判定小種類型。_________________________________
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