【正文】 ，小心吸出培養(yǎng)上清液，用預冷的PBS小心洗滌，晾干。如果細胞松散，可先用甲醇固定10分鐘?！　。?）把培養(yǎng)板放在冰蓋上，每孔加1mL 10%三氯醋酸(TCA)，在4℃放置10分鐘，吸取上清液?！　。?）用甲醇洗滌、晾干?！　。?） ，1% SDS,室溫下放置30分鐘?！　。?）混勻、移入閃爍瓶中，加5mL閃爍液，用液體閃爍計數(shù)儀測定每分脈沖數(shù)(cpm)，以cpm/106細胞或cpm/mg蛋白表示?！　腋∩L的細胞則采用離心法處理。　　四、細胞DNA合成測定　　(一)3HTdR摻入法　　此法的基本原理是：胸腺嘧啶核苷(TdR)是DNA特有的堿基，也是DNA合成的必需物質。用同位素3H標記TdR即3HTdR作為DNA合成的前體能摻入DAN合成代謝過程，通過測定細胞的放射性強度，可以反映細胞DAN的代謝及細胞增殖情況?！　』静襟E：　　（1）取對數(shù)生長期細胞，制成3108細胞/L的細胞懸液，接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔1mL?！　。?）將培養(yǎng)板放入37℃ 5%CO2孵箱中培養(yǎng)24小時左右。　?。?）在細胞處于對數(shù)生長期時，每孔加入100μL 3HTdR(108Bq/mL濃度，過濾除菌)，107Bq/mL?！　。?）繼續(xù)培養(yǎng)1～24小時(根據(jù)實驗要求確定)?！　。?）終止培養(yǎng)，小心吸棄培養(yǎng)上清液，用HBSS漂洗單層細胞2次，然后加2mL預冷的10%TCA(三氯醋酸)，放置10分鐘。如果細胞松散，應先用甲醇固定10分鐘。再用10%TCA重復洗2次，每次5分鐘。　?。?） ,在60℃處理30分鐘，然后使之冷至室溫?！　。?）收集上述裂解液，移入閃爍瓶中，加5mL閃爍液，用液體閃爍計數(shù)儀測定每分鐘脈沖數(shù)(cpm),結果以cpm/106細胞表示?！　?二)流式細胞儀測定DNA合成　　用流式細胞儀測定細胞增殖同期和DNA合成是90年代發(fā)展起來的新手段，不僅快速、準確、效果好，而且消除同位素標記的許多繁瑣方法和放射性污染?！　』緳z測程序：　?。?）取80%至接近匯合的細胞，%胰蛋白酶消化細胞，制備成單細胞懸液，細胞密度1109細胞/L，注意不能留有細胞碎片?！　。?）進行流式儀檢測。除檢測細胞周期時相變化和反應DNA合成情況外，還可了解染色體倍性；結合熒光免疫法，還可對細胞膜進行分析等?！　　　〉诹?jié) 電 鏡 觀 察 法　　　　電子顯微鏡的誕生和發(fā)展大大推動了人們對微觀世界的研究。借助電鏡技術，人們可以認識亞顯微結構和超微結構。離體培養(yǎng)細胞具有活力好、層次薄和易于取材、固定效果好等優(yōu)點，非常適宜于電鏡觀察。隨著電子顯微鏡技術的發(fā)展，當今的電鏡技術已包括了透射電鏡超薄切片技術與觀察，掃描電鏡樣品制備技術與觀察，電鏡細胞化學技術，電鏡免疫細胞化學技術，電鏡X射線顯微分析技術和電鏡圖像立體定量分析技術等，既可觀察細胞形態(tài)、結構，也可了解功能，并進行定性與定量分析?！　∫?、透射電鏡細胞樣品制備技術和觀察方法　　(一)原理　　透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)是利用陰極發(fā)射的電子，通過陽極中央的微孔形成的電子束穿透樣品獲得樣品的電子信號，經物鏡、中間鏡和投影鏡等多級電子放大至數(shù)百至數(shù)千萬倍，最后成像在熒光屏上便可即時觀察，或是投射到照相底片感光片上作為永久記錄。由于標本必須置于高真空中進行電鏡觀察，所以電鏡觀察的生物標本必須特殊制備，不能含水，離體的生物標本要迅速加以固定，以防產生結構改變。另外，電子的穿透力很弱，這就需要把樣品制成50nm～100nm厚的超薄切片(一個細胞切成100～200片)。為了使柔軟的生物組織能夠制成這樣薄的切片，并使切片耐受高真空和電子轟擊，所以在切片前要進行包埋。超薄切片技術是透射電鏡觀察成功的關鍵。　　超薄切片制作樣品過程大體分為取材、固定、漂洗、脫水、滲透包埋與聚合、切片、染色等。細胞超薄切片技術中如何把細胞完整無損地從培養(yǎng)瓶皿壁上包埋下來是最大的難題。新的定型產品無菌聚苯乙烯塑料薄膜的使用解決了這個難題，把薄膜放在培養(yǎng)瓶皿中，讓細胞直接長在塑料薄膜上，不僅細胞生長效果好，而且可與細胞一起包埋切片，省去了許多麻煩?！　?二)超薄切片基本操作步驟　　取材　　(1)離心法 適用于懸浮生長細胞或單層生長細胞，欲觀察細胞內部超微結構，取對數(shù)生長期的細胞低速離心，令細胞沉于錐形離心管底部，吸除上清液，立即加戊二醛固定。　　(2)原位法 將無菌的聚苯乙烯薄膜(已消毒包裝的成品)剪成適宜的小塊置入培養(yǎng)瓶中，然后接種細胞懸液，待細胞附于薄膜上并生長后，取出進行固定。　　 固定　　 將離心管中的細胞團塊或取出的薄膜移入青霉素小瓶中，在4℃用PBS漂洗3次，每次10分鐘。再用1% 四氧化鋨在4℃固定15～30分鐘，接著用PBS漂洗3次?！　?脫水　　 用系列丙酮在室溫下脫水?！　?50% 丙酮溶液1次，10分鐘?！　?70% 丙酮溶液1次，10分鐘?！　?90% 丙酮溶液2次，每次10分鐘?！　?100% 丙酮溶液3次，每次10分鐘。　　 浸透　　 吸棄瓶中脫水劑，加3mL純丙酮EPON812包埋劑(1:1體積比)，室溫下放置30分鐘后，棄去稀釋的包埋劑，加純包埋劑1mL，室溫放置2小時或過夜?！　“瘛　?1)細胞團塊 吸取混合包埋劑滴2滴于2號膠囊模塊孔的底部，把細胞團塊移入膠囊底部中心，注滿混合包埋劑，放60℃烤箱烘烤2小時，使之固化成硬塊?！　?2)細胞薄膜 將預先干燥的EPON明膠囊注滿混合包埋劑，倒蓋在單層細胞上，在60℃固化24小時。　　修塊 將包埋塊安裝在特制的夾具上，在顯微鏡下用單刃刀片修整去除表面的包埋劑，并做記號以便定位。　　切片 先將包埋塊固定在超薄切片機上，切厚約1μm的半薄切片，用蘇木素伊紅染色法染色。鏡下觀察細胞圖像，確定進行超薄切片的部位，并作標記。準備φ3mm，150～200目的銅網(wǎng)，用清洗液清洗，并用無水乙醇脫水干燥。制備好支持膜，小心放在銅網(wǎng)上。在超薄切片機上安裝三角形玻璃刀，固定包埋塊，切取50～70nm厚度的超薄切片，用睫毛筆挑選切片并用鋼絲環(huán)套取切片，貼在銅網(wǎng)有支持膜的一側，保存在干燥器皿中待染色?！　‰娮尤旧河靡桓蓛襞囵B(yǎng)皿，內放干凈的牙科石蠟片。在石蠟片上加1至數(shù)滴醋酸鈉染色液，用鑷子夾住載網(wǎng)邊緣，把貼有切片的一面朝下，使載網(wǎng)浮在液滴上，蓋上培養(yǎng)皿染色5～30分鐘，染色后盡快用雙蒸水清洗三次。用濾紙吸去載網(wǎng)多余的水分，置培養(yǎng)皿內自然干燥。再將載網(wǎng)放在另一只備有蠟片的培養(yǎng)皿中以同樣方法進行檸檬酸鉛的染色及清洗。片染后涼干待觀察?！　《?、掃描電鏡細胞樣品制備　　(一)原理　　超薄切片實際上是樣品的二維切片，不能表達細胞的三維結構，而且在觀察由切片所拍攝的顯微照片時，容易造成錯誤的印象。用掃描電子顯微鏡(Scanning electron microscope,SEM)能直接觀察標本表面的三維空間結構，真實地反映各種細胞表面和斷裂面的形貌特征。其照明源與透射電鏡基本相同，由電子槍發(fā)射的電子束經聚光鏡會聚成極細的電子探針，電子探針受掃描發(fā)生器控制，在樣品表面逐點逐線地掃描，樣品被電子轟擊所產生的二次電子被收集、轉換、放大，在電視熒光屏上同步掃描成像。二次電子的發(fā)射量與樣品的表面形貌有關，從而在熒光屏上出現(xiàn)表面起伏的樣品的立體圖像。掃描電鏡細胞樣品的預處理包括取材、固定、脫水等。　　(二)基本步驟　　 (1)取材 一般原則與超薄切片相似，但用于掃描電鏡觀察的樣品塊略大，通常為58mm左右?！　?2)固定 鋪片培養(yǎng)的細胞取出浸入PBS中，漂洗細胞表面。然后將細胞鋪片放入青霉素小瓶中，加4℃預冷的3% 戊二醛，在4℃固定2小時或過夜，吸出固定劑，用PBS浸洗2次，每次10分鐘，再用4℃預冷的1% 鋨酸，在4℃固定1小時，然后用PBS浸洗2次，每次10分鐘?！　?3)脫水 丙酮/醋酸異戊酯(1:1)10分鐘，接下來醋酸異戊酯30分鐘，或用系列梯度酒精(30%、50%、70%、80%、90%、95%和100%)脫水，每種濃度酒精通過2次，每次15分鐘?！　?4)干燥 以臨界干燥法最理想，但必需要有專門的儀器，當實驗室不具備此種儀器時，可采用冰凍干燥法和乙腈干燥法。乙腈干燥法的關鍵是乙腈置換。樣品經上述處理后，浸入50%的乙腈水溶液中，然后依次更換70%、80%、90%、95%、100%的乙腈溶液，每次浸泡15～20分鐘，最后再換100%乙腈。然后進行真空干燥。即將乙腈置換后的樣品連同青霉素瓶一起放到真空鍍膜臺的空中置內，抽低真空，一般需30～50分鐘。樣品干燥后，待其溫度升至室溫時再放氣，取出樣品?！　?5)樣品導電處理：用真空噴鍍法。所用儀器為真空噴鍍儀，樣品被安置在離蒸發(fā)源約10～15cm處的樣品臺上，樣品進行旋轉活動，先噴碳，后噴金，噴鍍應均勻，完成后待鏡下觀察?！　?