【正文】 ，小心吸出培養(yǎng)上清液，用預(yù)冷的PBS小心洗滌，晾干。如果細(xì)胞松散，可先用甲醇固定10分鐘?！　。?）把培養(yǎng)板放在冰蓋上，每孔加1mL 10%三氯醋酸(TCA)，在4℃放置10分鐘，吸取上清液?！　。?）用甲醇洗滌、晾干?！　。?） ，1% SDS,室溫下放置30分鐘?！　。?）混勻、移入閃爍瓶中，加5mL閃爍液，用液體閃爍計(jì)數(shù)儀測(cè)定每分脈沖數(shù)(cpm)，以cpm/106細(xì)胞或cpm/mg蛋白表示?！　?duì)懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞則采用離心法處理?！　∷?、細(xì)胞DNA合成測(cè)定　　(一)3HTdR摻入法　　此法的基本原理是：胸腺嘧啶核苷(TdR)是DNA特有的堿基，也是DNA合成的必需物質(zhì)。用同位素3H標(biāo)記TdR即3HTdR作為DNA合成的前體能摻入DAN合成代謝過(guò)程，通過(guò)測(cè)定細(xì)胞的放射性強(qiáng)度，可以反映細(xì)胞DAN的代謝及細(xì)胞增殖情況?！　』静襟E：　?。?）取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制成3108細(xì)胞/L的細(xì)胞懸液，接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔1mL?！　。?）將培養(yǎng)板放入37℃ 5%CO2孵箱中培養(yǎng)24小時(shí)左右。　?。?）在細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，每孔加入100μL 3HTdR(108Bq/mL濃度，過(guò)濾除菌)，107Bq/mL?！　。?）繼續(xù)培養(yǎng)1～24小時(shí)(根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求確定)?！　。?）終止培養(yǎng)，小心吸棄培養(yǎng)上清液，用HBSS漂洗單層細(xì)胞2次，然后加2mL預(yù)冷的10%TCA(三氯醋酸)，放置10分鐘。如果細(xì)胞松散，應(yīng)先用甲醇固定10分鐘。再用10%TCA重復(fù)洗2次，每次5分鐘?！　。?） ,在60℃處理30分鐘，然后使之冷至室溫?！　。?）收集上述裂解液，移入閃爍瓶中，加5mL閃爍液，用液體閃爍計(jì)數(shù)儀測(cè)定每分鐘脈沖數(shù)(cpm),結(jié)果以cpm/106細(xì)胞表示?！　?二)流式細(xì)胞儀測(cè)定DNA合成　　用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞增殖同期和DNA合成是90年代發(fā)展起來(lái)的新手段，不僅快速、準(zhǔn)確、效果好，而且消除同位素標(biāo)記的許多繁瑣方法和放射性污染。　　基本檢測(cè)程序：　?。?）取80%至接近匯合的細(xì)胞，%胰蛋白酶消化細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度1109細(xì)胞/L，注意不能留有細(xì)胞碎片?！　。?）進(jìn)行流式儀檢測(cè)。除檢測(cè)細(xì)胞周期時(shí)相變化和反應(yīng)DNA合成情況外，還可了解染色體倍性；結(jié)合熒光免疫法，還可對(duì)細(xì)胞膜進(jìn)行分析等?！　　　〉诹?jié) 電 鏡 觀 察 法　　　　電子顯微鏡的誕生和發(fā)展大大推動(dòng)了人們對(duì)微觀世界的研究。借助電鏡技術(shù)，人們可以認(rèn)識(shí)亞顯微結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)。離體培養(yǎng)細(xì)胞具有活力好、層次薄和易于取材、固定效果好等優(yōu)點(diǎn)，非常適宜于電鏡觀察。隨著電子顯微鏡技術(shù)的發(fā)展，當(dāng)今的電鏡技術(shù)已包括了透射電鏡超薄切片技術(shù)與觀察，掃描電鏡樣品制備技術(shù)與觀察，電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，電鏡X射線顯微分析技術(shù)和電鏡圖像立體定量分析技術(shù)等，既可觀察細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)，也可了解功能，并進(jìn)行定性與定量分析?！　∫?、透射電鏡細(xì)胞樣品制備技術(shù)和觀察方法　　(一)原理　　透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)是利用陰極發(fā)射的電子，通過(guò)陽(yáng)極中央的微孔形成的電子束穿透樣品獲得樣品的電子信號(hào)，經(jīng)物鏡、中間鏡和投影鏡等多級(jí)電子放大至數(shù)百至數(shù)千萬(wàn)倍，最后成像在熒光屏上便可即時(shí)觀察，或是投射到照相底片感光片上作為永久記錄。由于標(biāo)本必須置于高真空中進(jìn)行電鏡觀察，所以電鏡觀察的生物標(biāo)本必須特殊制備，不能含水，離體的生物標(biāo)本要迅速加以固定，以防產(chǎn)生結(jié)構(gòu)改變。另外，電子的穿透力很弱，這就需要把樣品制成50nm～100nm厚的超薄切片(一個(gè)細(xì)胞切成100～200片)。為了使柔軟的生物組織能夠制成這樣薄的切片，并使切片耐受高真空和電子轟擊，所以在切片前要進(jìn)行包埋。超薄切片技術(shù)是透射電鏡觀察成功的關(guān)鍵?！　〕∏衅谱鳂悠愤^(guò)程大體分為取材、固定、漂洗、脫水、滲透包埋與聚合、切片、染色等。細(xì)胞超薄切片技術(shù)中如何把細(xì)胞完整無(wú)損地從培養(yǎng)瓶皿壁上包埋下來(lái)是最大的難題。新的定型產(chǎn)品無(wú)菌聚苯乙烯塑料薄膜的使用解決了這個(gè)難題，把薄膜放在培養(yǎng)瓶皿中，讓細(xì)胞直接長(zhǎng)在塑料薄膜上，不僅細(xì)胞生長(zhǎng)效果好，而且可與細(xì)胞一起包埋切片，省去了許多麻煩?！　?二)超薄切片基本操作步驟　　取材　　(1)離心法 適用于懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞或單層生長(zhǎng)細(xì)胞，欲觀察細(xì)胞內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞低速離心，令細(xì)胞沉于錐形離心管底部，吸除上清液，立即加戊二醛固定?！　?2)原位法 將無(wú)菌的聚苯乙烯薄膜(已消毒包裝的成品)剪成適宜的小塊置入培養(yǎng)瓶中，然后接種細(xì)胞懸液，待細(xì)胞附于薄膜上并生長(zhǎng)后，取出進(jìn)行固定。　　 固定　　 將離心管中的細(xì)胞團(tuán)塊或取出的薄膜移入青霉素小瓶中，在4℃用PBS漂洗3次，每次10分鐘。再用1% 四氧化鋨在4℃固定15～30分鐘，接著用PBS漂洗3次?！　?脫水　　 用系列丙酮在室溫下脫水。　　 50% 丙酮溶液1次，10分鐘?！　?70% 丙酮溶液1次，10分鐘?！　?90% 丙酮溶液2次，每次10分鐘。　　 100% 丙酮溶液3次，每次10分鐘?！　?浸透　　 吸棄瓶中脫水劑，加3mL純丙酮EPON812包埋劑(1:1體積比)，室溫下放置30分鐘后，棄去稀釋的包埋劑，加純包埋劑1mL，室溫放置2小時(shí)或過(guò)夜?！　“瘛　?1)細(xì)胞團(tuán)塊 吸取混合包埋劑滴2滴于2號(hào)膠囊模塊孔的底部，把細(xì)胞團(tuán)塊移入膠囊底部中心，注滿混合包埋劑，放60℃烤箱烘烤2小時(shí)，使之固化成硬塊?！　?2)細(xì)胞薄膜 將預(yù)先干燥的EPON明膠囊注滿混合包埋劑，倒蓋在單層細(xì)胞上，在60℃固化24小時(shí)?！　⌒迚K 將包埋塊安裝在特制的夾具上，在顯微鏡下用單刃刀片修整去除表面的包埋劑，并做記號(hào)以便定位?！　∏衅?先將包埋塊固定在超薄切片機(jī)上，切厚約1μm的半薄切片，用蘇木素伊紅染色法染色。鏡下觀察細(xì)胞圖像，確定進(jìn)行超薄切片的部位，并作標(biāo)記。準(zhǔn)備φ3mm，150～200目的銅網(wǎng)，用清洗液清洗，并用無(wú)水乙醇脫水干燥。制備好支持膜，小心放在銅網(wǎng)上。在超薄切片機(jī)上安裝三角形玻璃刀，固定包埋塊，切取50～70nm厚度的超薄切片，用睫毛筆挑選切片并用鋼絲環(huán)套取切片，貼在銅網(wǎng)有支持膜的一側(cè)，保存在干燥器皿中待染色?！　‰娮尤旧河靡桓蓛襞囵B(yǎng)皿，內(nèi)放干凈的牙科石蠟片。在石蠟片上加1至數(shù)滴醋酸鈉染色液，用鑷子夾住載網(wǎng)邊緣，把貼有切片的一面朝下，使載網(wǎng)浮在液滴上，蓋上培養(yǎng)皿染色5～30分鐘，染色后盡快用雙蒸水清洗三次。用濾紙吸去載網(wǎng)多余的水分，置培養(yǎng)皿內(nèi)自然干燥。再將載網(wǎng)放在另一只備有蠟片的培養(yǎng)皿中以同樣方法進(jìn)行檸檬酸鉛的染色及清洗。片染后涼干待觀察?！　《?、掃描電鏡細(xì)胞樣品制備　　(一)原理　　超薄切片實(shí)際上是樣品的二維切片，不能表達(dá)細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)，而且在觀察由切片所拍攝的顯微照片時(shí)，容易造成錯(cuò)誤的印象。用掃描電子顯微鏡(Scanning electron microscope,SEM)能直接觀察標(biāo)本表面的三維空間結(jié)構(gòu)，真實(shí)地反映各種細(xì)胞表面和斷裂面的形貌特征。其照明源與透射電鏡基本相同，由電子槍發(fā)射的電子束經(jīng)聚光鏡會(huì)聚成極細(xì)的電子探針，電子探針受掃描發(fā)生器控制，在樣品表面逐點(diǎn)逐線地掃描，樣品被電子轟擊所產(chǎn)生的二次電子被收集、轉(zhuǎn)換、放大，在電視熒光屏上同步掃描成像。二次電子的發(fā)射量與樣品的表面形貌有關(guān)，從而在熒光屏上出現(xiàn)表面起伏的樣品的立體圖像。掃描電鏡細(xì)胞樣品的預(yù)處理包括取材、固定、脫水等?！　?二)基本步驟　　 (1)取材 一般原則與超薄切片相似，但用于掃描電鏡觀察的樣品塊略大，通常為58mm左右?！　?2)固定 鋪片培養(yǎng)的細(xì)胞取出浸入PBS中，漂洗細(xì)胞表面。然后將細(xì)胞鋪片放入青霉素小瓶中，加4℃預(yù)冷的3% 戊二醛，在4℃固定2小時(shí)或過(guò)夜，吸出固定劑，用PBS浸洗2次，每次10分鐘，再用4℃預(yù)冷的1% 鋨酸，在4℃固定1小時(shí)，然后用PBS浸洗2次，每次10分鐘?！　?3)脫水 丙酮/醋酸異戊酯(1:1)10分鐘，接下來(lái)醋酸異戊酯30分鐘，或用系列梯度酒精(30%、50%、70%、80%、90%、95%和100%)脫水，每種濃度酒精通過(guò)2次，每次15分鐘?！　?4)干燥 以臨界干燥法最理想，但必需要有專門的儀器，當(dāng)實(shí)驗(yàn)室不具備此種儀器時(shí)，可采用冰凍干燥法和乙腈干燥法。乙腈干燥法的關(guān)鍵是乙腈置換。樣品經(jīng)上述處理后，浸入50%的乙腈水溶液中，然后依次更換70%、80%、90%、95%、100%的乙腈溶液，每次浸泡15～20分鐘，最后再換100%乙腈。然后進(jìn)行真空干燥。即將乙腈置換后的樣品連同青霉素瓶一起放到真空鍍膜臺(tái)的空中置內(nèi)，抽低真空，一般需30～50分鐘。樣品干燥后，待其溫度升至室溫時(shí)再放氣，取出樣品?！　?5)樣品導(dǎo)電處理：用真空噴鍍法。所用儀器為真空噴鍍儀，樣品被安置在離蒸發(fā)源約10～15cm處的樣品臺(tái)上，樣品進(jìn)行旋轉(zhuǎn)活動(dòng)，先噴碳，后噴金，噴鍍應(yīng)均勻，完成后待鏡下觀察?！　?