【正文】 液現(xiàn)用現(xiàn)配）35min，時(shí)間長(zhǎng)短依病組織不同而異，然后直接移至PSA平板培養(yǎng)基上(為防止細(xì)菌污染，可在培養(yǎng)基中加入1000ppm鏈霉素10毫升)，倒置于20—25℃室溫下，待菌落長(zhǎng)出后挑取前緣菌絲，回接于PSA斜面培養(yǎng)基上，在25℃溫箱中培養(yǎng)，待菌落顏色變深后，在無菌條件下鏡檢是否是玉米大斑病菌，弱僅有玉米大斑病菌的孢子，則說明已獲得了純培養(yǎng)，否則，則需要繼續(xù)轉(zhuǎn)至斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行純化，直至獲得純培養(yǎng)。 (2)種子內(nèi)部病原菌的分離（小麥根腐病菌的分離） 選擇典型的小麥黑胚粒3—4個(gè)，在70%的酒精中浸2—3秒鐘后，%升汞溶液中表面消毒2—3分鐘（處理時(shí)間可自30秒至30分鐘不等），然后取出小麥粒，以滅菌水沖洗3次，再移至已倒好的馬鈴薯瓊脂平板培養(yǎng)基上，注意要以小麥的黑胚部位著靠在培養(yǎng)基上，倒置在25℃溫箱中培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)出后，挑取前緣菌絲于馬鈴薯斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)34天后，無菌條件下鏡檢是否獲得純培養(yǎng)。 (3)病組織內(nèi)部病原菌的分離（梨褐腐病菌的分離） 取梨褐腐病病果沾取95%酒精，用酒精火焰三次消毒后，以在燈焰滅過菌的解剖刀在果面病、健交界處切開，挑取豆粒大小的病組織放到馬鈴薯瓊脂平板培養(yǎng)基上，每皿放3—4塊，倒置于25℃溫箱中培養(yǎng)2—3天。菌絲長(zhǎng)出后轉(zhuǎn)至馬鈴薯瓊脂斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)34天后，無菌條件下鏡檢是否獲得純培養(yǎng)。 ：稀釋分離法適用于細(xì)菌、土壤菌及產(chǎn)生孢子多的真菌等病原菌的分離，本次實(shí)驗(yàn)以白菜軟腐病作為材料進(jìn)行分類離。 白菜軟腐病最易伴生腐生細(xì)菌，分離時(shí)需以病組織接種健康菜幫上，經(jīng)數(shù)次轉(zhuǎn)種予以純化，其純化方法是將菜幫經(jīng)多次換水沖洗后，再用無菌水洗三次，切成適當(dāng)大小，放在15厘米直徑的培養(yǎng)皿中，菜幫下襯以吸水紙保溫。用無菌解剖刀挑取病組織少許抹在菜幫的人為傷口上，培養(yǎng)在20—25℃下，經(jīng)1天左右呈現(xiàn)腐爛，如此反復(fù)轉(zhuǎn)種幾次，至病斑純凈為止。 分離時(shí)，在新的水爛斑邊緣挑取少量病組織在無菌水試管中配成菌懸液，取滅菌培養(yǎng)皿3付，標(biāo)好次序，其內(nèi)各置無菌水1毫升，用移置環(huán)移取菌懸液一環(huán)，放在第1皿水中混合均勻，從中挑取一環(huán)稀釋液至第2皿，再以同法稀釋成第3皿，取熔化后冷至45℃左右的(一般將化好的培養(yǎng)基瓶靠近鼻尖，以不燙為度)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，每皿倒約15毫升，沿著桌面輕輕搖勻，凝固后倒置于26—28℃的溫箱中培養(yǎng)，1—2日后可見白色，圓形或近圓形直徑為1—2毫米的菌落，從中選典型菌落用移植環(huán)（劃線法）移入牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每組轉(zhuǎn)4—5管，注意過早出現(xiàn)的大型菌落多為腐生細(xì)菌。 以上分離實(shí)驗(yàn)也可以劃線法進(jìn)行，方法是先取兩付滅菌培養(yǎng)皿，每皿倒入約15毫升熔化的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，沿桌面輕輕搖勻，制成平板，然后用移置環(huán)沾取一環(huán)稀釋好的菌懸液，在第一個(gè)培養(yǎng)皿平面培養(yǎng)基的左方長(zhǎng)方形區(qū)內(nèi)劃平行線5—7條，再以此移置環(huán)繼續(xù)向右(和左方小區(qū)內(nèi)的幾條平行線成一定角度)劃5—7條平行線，依此法劃兩皿，倒置于26—28℃溫箱中培養(yǎng)，1—2日后挑單個(gè)典型菌落移到斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)待用。 如果因季節(jié)關(guān)系難得白菜軟腐病試材，則可用黃瓜細(xì)菌性角斑病、棉花角斑病、水稻白葉枯病病葉作試材進(jìn)行分離培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。方法是取新鮮病葉，在病、健交接處取幾小塊病組織，以無菌水經(jīng)多次換洗表面消毒后，放在比色板或凹玻片的凹窩內(nèi)(凹窩要經(jīng)兩次酒精火焰消毒)，以吸管吸取無菌水滴入窩，并以滅菌的玻璃棒搗碎病組織，靜置幾分鐘可得菌懸液，之后以上述劃線法進(jìn)行分離，注意葡萄糖對(duì)稻白葉枯病菌有抑制作用，故分離稻白葉枯病菌不能用葡萄糖配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。 三、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 (一)清潔環(huán)境：分離工作嚴(yán)格說應(yīng)在無菌條下進(jìn)行，無菌室或無菌箱是分離不可缺少的設(shè)施。若限于條件實(shí)驗(yàn)只能在普通房間進(jìn)行時(shí)，必須對(duì)房間進(jìn)行徹底掃除，清潔環(huán)境、搞好衛(wèi)生。地上多灑些水，以消除室內(nèi)塵埃，分離開始前準(zhǔn)備好一切用品，避免工作過程中頻繁走動(dòng)，以破壞環(huán)境帶來雜菌，工作臺(tái)上鋪好濕毛巾，點(diǎn)燃酒精燈。 (二)實(shí)驗(yàn)材料及用品準(zhǔn)備 本次實(shí)驗(yàn)35人一組，請(qǐng)認(rèn)真檢查好下試材和用品是否齊備。 1病組織材料 小麥根腐病黑胚粒5粒。 玉米大斑病病葉1片。 白菜軟腐病病幫 3塊(相鄰兩組共用)； 梨褐腐病病果 1個(gè)(相鄰兩組共用)。 2用品準(zhǔn)備 %升汞溶液(廣口瓶盛裝)； 95%酒精(廣口瓶盛裝)； 1000ppm鏈霉素； 瓶裝牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基； 瓶裝馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基； 此外，還有以下備品，無菌水1瓶，滅菌培養(yǎng)皿6付，滅菌1毫升吸管2支，解剖剪、解剖刀和鑷子各1把，移植環(huán)，移植鉤、酒精燈、琺瑯盤和試管架各1個(gè)，毛巾1條，玻璃鉛筆1支及火柴等。 四、作業(yè)：每人交分離到的純菌種一支。 五、思考題 1分離植物病原菌常用的方法有幾種? 這些方法適用于分離哪類病原菌? 怎樣分離? 2分離植物病原物時(shí)，為什么要選擇新鮮病材料，并且在病健交界處取樣? 沒有新鮮病材料怎么辦? 3試分析分離工作成敗的原因。 附：關(guān)于柯赫氏證病法則 (Koch′s postulate) 1882年，柯赫(Koch)在研究了人和動(dòng)物的病害之后，提出了確定一種微生物致病性的三個(gè)必要條件：(一)這種微生物經(jīng)常與某種病害有聯(lián)系，發(fā)生這種病害往往就有這種微生物存在；(二)從病組織上可以分離得到這種微生物的純培養(yǎng)，并且可以在各種培養(yǎng)基上研究它的性狀；(三)將培養(yǎng)的菌種接種在健全的寄主上，可誘發(fā)出與原來相同的病害；史密斯(Smith)在1905年又補(bǔ)充以下一條，(四)從接種后發(fā)病的植物上，能再分離到原來的微生物。 實(shí)驗(yàn)四 真菌孢子的萌發(fā) 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?欲了解病菌生活力的強(qiáng)弱，生存期的長(zhǎng)短，有效傳播距離，抗藥性的大小，生活史，環(huán)境與發(fā)病的關(guān)系以及有些病菌的種類鑒定等，都必須進(jìn)行孢子萌發(fā)試驗(yàn)。孢子能否萌發(fā)，萌發(fā)率的高低，萌發(fā)勢(shì)的強(qiáng)弱以及萌發(fā)的方式等既受病菌自身內(nèi)在的因素影響，也受外界環(huán)境條件制約，因此要達(dá)到萌發(fā)試驗(yàn)的目的，必須充分掌握萌發(fā)所需的各種條件，本次實(shí)驗(yàn)主要學(xué)習(xí)孢子萌發(fā)常用的方法，同時(shí)通過實(shí)驗(yàn)理解各種孢子萌發(fā)所需條件不同。 二、內(nèi)容、材料和方法 孢子萌發(fā)的方法很多，有些真菌的孢子須用特殊的方法才能萌發(fā)，以下僅實(shí)驗(yàn)常用的方法。 (一)懸滴法 1材料：玉米大斑病菌斜面菌種。 2方法：在潔凈的蓋玻片中央滴玉米大斑病菌孢子懸浮液一滴，注意滴成圓形，大小適當(dāng)，菌懸液濃度以顯微鏡低倍鏡頭每個(gè)視野約20個(gè)孢子為宜。然后翻轉(zhuǎn)蓋片制成懸滴，并封閉在特制的玻環(huán)內(nèi)，再將玻環(huán)放在底部盛少許水的培養(yǎng)皿中，蓋好皿蓋，放置在26—28℃溫箱中培養(yǎng)，4—5小時(shí)后檢查萌發(fā)結(jié)果。 此法也可改用直接用培養(yǎng)皿蓋的里面作懸滴進(jìn)行，即用玻璃筆在皿蓋里面劃方格，在方格中央滴孢子懸液，然后慢慢轉(zhuǎn)皿蓋。蓋在盛有少量蒸餾水的皿底上，保溫保濕培養(yǎng)，此法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便，而且適用于大量孢子萌發(fā)測(cè)定。 (二)液滴法 ：小麥根腐病菌斜面菌種。 ：在培養(yǎng)皿內(nèi)放一“井”字或“U”形玻璃棒，皿底加蒸餾水少許或襯上吸水紙或加幾個(gè)脫脂棉球吸水保濕，玻璃棒上放載玻片，其上分別滴2或3滴小麥根腐病菌孢子懸浮液〔濃度同(一)〕，蓋好皿蓋，置于26—28℃溫箱中培養(yǎng)，4—5小時(shí)后，鏡檢萌發(fā)結(jié)果。 此法也可發(fā)展為將配好的孢子懸液直接加在培養(yǎng)皿中進(jìn)行萌發(fā)，一般一個(gè)培養(yǎng)皿中加10毫升左右，不能太多，然后直接鏡檢萌發(fā)結(jié)果，優(yōu)點(diǎn)是一次可測(cè)定大量孢子。 (三)瓊脂培養(yǎng)基法 對(duì)于某些不適于直接在水滴中萌發(fā)的真菌可采用此法。 ：新采集的帶有夏孢子堆的小麥稈銹病病葉或小麥白粉病病葉。 ：取潔凈的載玻片，在熔化并冷至50℃左右的2%水瓊脂培養(yǎng)基中沾一下，待凝成薄層后，去掉一面瓊脂培養(yǎng)基，將有瓊脂培養(yǎng)基的一面朝上，平放在培養(yǎng)皿的“U”形玻棒上，再將稈銹菌夏孢子或白粉菌的分生孢子輕輕彈落或涂抹在瓊脂平面上。保溫培養(yǎng)，麥稈銹菌夏孢子培養(yǎng)在20℃溫度下，麥白粉病分生孢子培養(yǎng)在10—12℃下，24小時(shí)后鏡檢萌發(fā)結(jié)果。 此法也可以直接在培養(yǎng)皿中做成的水瓊脂平板上進(jìn)行。 (四)載片引濕法 此法用于不適于直接在水滴中萌發(fā)的某些真菌。 ：玉米瘤黑粉病菌的黑粉孢子。 ：在培養(yǎng)皿中放一“V”或“U”形玻璃棒，其上放一載玻片，再取寬1厘米，長(zhǎng)4厘米的濾紙條一個(gè)放在皿內(nèi)。滅菌后皿底加少許滅菌水，將濾紙條橫放在載玻片上，崩緊，兩端拖入水中，吸滴水，再在紙上滴一滴玉米瘤黑粉病菌黑粉孢子懸浮液，蓋上皿蓋，在25℃溫箱中培養(yǎng)，逐日檢查萌發(fā)的結(jié)果。 三、孢子萌發(fā)的記載方法孢子萌發(fā)是先吸水膨脹，然后長(zhǎng)出芽管，通常以芽管長(zhǎng)度超過孢子直徑一半(不是正圓形的孢子以短徑為準(zhǔn))作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，記載萌發(fā)的方法有以下幾種。 (一)萌發(fā)率 即萌發(fā)一定時(shí)間后，隨機(jī)取一定數(shù)目(至少500個(gè))的孢子，檢查萌發(fā)的孢子數(shù)，求出萌發(fā)百分率，如果用該法記錄兩種或幾種不同處理時(shí)，要注意嚴(yán)格掌握檢查時(shí)間。 (二)萌發(fā)時(shí)間 即測(cè)定孢子萌發(fā)達(dá)到一定萌發(fā)率所需時(shí)間。 (三)芽管平均長(zhǎng)度 即測(cè)定一定數(shù)目已萌發(fā)孢子的芽管長(zhǎng)度，求其平均值。 此外，有些萌發(fā)試驗(yàn)，如藥效測(cè)定等，還需注意記錄芽管的寬度形狀變化以及是否有分枝等。 四、作業(yè) 鏡檢玉米大斑病菌或小麥根腐病菌分生孢子的萌發(fā)率。 五、思考題 1孢子萌發(fā)在植病研究工作中有什么重要意義? 在作萌發(fā)試驗(yàn)時(shí)，特別要注意哪些問題? 2幾種孢子萌發(fā)方法各自適用于哪些真菌? 記載孢子萌發(fā)的方法有幾種? 各種什么優(yōu)缺點(diǎn)。 附：植物病原真菌的顯微計(jì)測(cè) 植物病理學(xué)上的顯微計(jì)測(cè)，主要是測(cè)量微生物的大小，如真菌的菌絲體、子實(shí)體和孢子的大小等，孢子的計(jì)測(cè)尤其重要。顯微計(jì)測(cè)的方法很多，如接目測(cè)微尺法，顯微繪圖儀法，螺旋測(cè)微計(jì)法，放映計(jì)測(cè)法和鏡臺(tái)十字推進(jìn)器法等，但最常用的是接目測(cè)微尺計(jì)測(cè)法。 1接目測(cè)微尺簡(jiǎn)介 接目測(cè)微尺是一個(gè)可裝入目鏡內(nèi)刻有橫隔的圓玻璃片，在顯微鏡下，隔間所代表的距離因顯微鏡放大倍數(shù)和鏡筒的長(zhǎng)短而不同。故須用鏡臺(tái)測(cè)微尺確定，鏡臺(tái)測(cè)微尺是大小形狀和載玻片相似的一種特制玻片，中央有圓圈，圈中央刻有一尺，尺長(zhǎng)為一毫米，分為10大格或100小格，每小格為1/100毫米或10微米。 2準(zhǔn)定接目測(cè)微尺的方法 (1)將顯微鏡鏡筒調(diào)節(jié)到固定的長(zhǎng)度 (2)將接目測(cè)微尺放在接目鏡內(nèi)，由鏡頭向下看，上面的格紋，應(yīng)極清楚。 (3)將鏡臺(tái)測(cè)微尺放在鏡臺(tái)上 (4)先用低倍鏡觀察，凡兩尺任何兩線相符時(shí)，即記下每一尺上的格數(shù)，如此觀察三次，計(jì)算接目測(cè)微尺每格的長(zhǎng)度。 鏡臺(tái)測(cè)微尺 接目測(cè)微尺 第一次觀察 12格 25格 第二次觀察 6格 13格 第三次觀察 30格 64格 合 計(jì) 48格 102格 接目測(cè)微尺每格=10微米48/102= (5)用同樣方法準(zhǔn)定高倍鏡下接目測(cè)微尺每格的長(zhǎng)度。 (6)準(zhǔn)定數(shù)值只適用于準(zhǔn)定的顯微鏡，換用其它顯微鏡或鏡頭和鏡筒長(zhǎng)度改變時(shí)，必須重新確定。 3孢子計(jì)測(cè)數(shù)目及大小記載法 一般量菌絲體的寬度，分生孢子梗的長(zhǎng)和寬，子囊果，子囊、分生孢子器的大小可選其大者或小者各量5—6個(gè)，分生孢子選成熟而大小不同的各量20—30個(gè)，或隨機(jī)量50個(gè)。 記載方法：一般記載孢子大小的幅度，—，小數(shù)點(diǎn)以后數(shù)字，大小在20μ以下的可將尾數(shù)去掉，；大小在20—75μ之間的無須有小數(shù)點(diǎn)，大小在75—100μ之間的可將尾數(shù)進(jìn)為5或10。 實(shí)驗(yàn)五 植物病原物的接種 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 人工使病原物與寄主植物感病部位接觸，創(chuàng)造條件使病原物侵入并誘致寄主發(fā)病叫接種，接種是證病過程的重要步驟，在研究寄生現(xiàn)象發(fā)病規(guī)律，測(cè)定品種抗病性，藥劑防病效果時(shí)都需要接種。因此，接種是植病工作者必須掌握的基本技術(shù)環(huán)節(jié)。 植物病害人工接種方法，是根據(jù)病害的傳染方式和侵染途徑設(shè)計(jì)的，植物病害的種類很多、其傳染方式和侵染途徑各異。因此接種方法也不相同。本次實(shí)驗(yàn)以玉米大斑病，小麥根腐病，小麥稈銹病，梨褐腐病等為內(nèi)容學(xué)習(xí)常用的接種方法。 二、內(nèi)容、材料和方法 (一)拌土法(小麥根腐病) 拌土法適于土壤傳染的病害，方法是將消毒的土壤分別裝入兩個(gè)小花盆中，其中一盆表層覆以一厘米厚的菌土，菌土是用玉米砂培養(yǎng)菌1份加消毒土5份混合而成，另一盆不接種(不覆菌土)作為對(duì)照。%升汞表面消毒3分鐘并用無菌水洗3次的小麥種子，分別播種在兩個(gè)花盆內(nèi)，插上標(biāo)牌，注明接種日期，方法病害名稱及接種人姓名，花盆放在室溫下，澆水保濕，遮陰管理，待幼苗出土展開葉子后(大約一周)，觀察并記載根腐病發(fā)生情況。 (二)噴霧法(玉米大斑病)氣流及雨水傳播的病害常用此法接種，將培養(yǎng)好的玉米大斑病的斜面菌種一支，用移植鉤刮于裝有100毫升無菌水的三角瓶中，用力振蕩，待孢子洗下后，以紗布過濾，即成孢子菌絲懸液，用衛(wèi)生噴霧器均勻噴布在麥苗上。同時(shí)設(shè)一不噴菌液而噴無菌水的作對(duì)照，用塑料罩保濕48小時(shí)，揭布后正常管理，7天后作發(fā)病調(diào)查。 (三)涂抹法(小麥稈銹病) 這也是氣流傳播的病害常用的接種方法，用于禾本科銹病接種。方法是用姆指沾銹菌夏孢子懸液自下向上輕輕涂欲接種的小麥葉片，也可先用手指沾水摩擦葉片，使葉表有一層水膜，然后將夏孢子粉抹在上面，以不涂抹孢子懸液或孢子粉的作為對(duì)照。塑料罩保濕48小時(shí)后揭布，正常管理，7天后作發(fā)病調(diào)查。 (四)創(chuàng)傷接種法(白菜軟腐病及梨褐腐病) 創(chuàng)傷接種法是傷口侵入的弱寄生菌常用的接種方法。 ：取切成適當(dāng)大小的白菜幫兩塊、經(jīng)水洗，待水稍干后，以10%漂白粉溶液作表面消毒，分放在兩個(gè)滅過菌的上下鋪有吸水紙的培養(yǎng)皿中，用酒精擦過的玻璃棒順著白菜幫打三排不穿透的孔穴。將培養(yǎng)好