腺病毒包裝注意事項(xiàng)docxdocx-資料下載頁
2025-07-18 19:22本頁面
【正文】 感染了病毒。一些細(xì)胞感染之后，釋放出病毒后再感染其他細(xì)胞，這樣，整個(gè)過程都在發(fā)生病毒的增殖周期。所以，我看文獻(xiàn)講，做SDSPAGE鑒定，一般感染量要大，一開始，保證每個(gè)細(xì)胞都感染上病毒；而做病毒增殖，感染量要低。直接取上清或者一點(diǎn)細(xì)胞，量可能有點(diǎn)小。最好做一下濃縮。檢測(cè)低限與蛋白量、一抗質(zhì)量、檢測(cè)方法有一定關(guān)系。般CsCl離心可以起到濃縮和純化的作用。如果你的條件達(dá)不到，可以不做。但是要保證你的病毒原始滴度可以用于試驗(yàn)。我以前做動(dòng)物試驗(yàn)，測(cè)定免疫效果，也沒有CsCl離心。轉(zhuǎn)染條件看你使用的轉(zhuǎn)染試劑的要求，不同的轉(zhuǎn)染試劑要求不同，從60%到95%都有。一般的8090%都基本可以。腺病毒純化包括3步：1．不連續(xù)氯化銫密度梯度離心去除主要的細(xì)胞污染物和缺陷性病毒顆粒。2．連續(xù)氯化銫密度梯度離心將感染性病毒顆粒和缺陷性病毒顆粒分開。3．透析去除氯化銫（去鹽）。連續(xù)密度梯度需要過夜離心。為保證時(shí)間安排，建議從早上開始第1步，這樣大約在午后就可開始過夜離心。按照此時(shí)間安排，完整的一個(gè)純化過程包括去鹽在內(nèi)大約需2天時(shí)間。下面所有操作均以SW28轉(zhuǎn)子30ml離心管為例。理論上講，溶液體積調(diào)整后也可用其它大小的離心管，切記在離心后收集病毒帶。由于有些污染物和成熟的病毒顆粒密度相近，因此這二條帶之間的距離很小。在大直徑的離心管中，病毒帶更細(xì)，離原始位置更遠(yuǎn)，這樣，病毒帶在30ml離心管中比在12ml的管中更易分辨。不連續(xù)密度梯度離心注意：為確保氯化銫密度梯度后較易分辨病毒帶，擴(kuò)增病毒至少需要3108細(xì)胞。1．預(yù)冷離心轉(zhuǎn)子至4℃。2．在離心管中緩慢加入8ml氯化銫（53g+87ml10mMTrzHCL，PH），再非常輕緩地加入6ml+92ml10mMTrisHCL，PH）。病毒最終的純度有賴于密度梯度的質(zhì)量。3．超凈臺(tái)中在不連續(xù)梯度頂部加入20mlDMEM5%病毒保存液，病毒量必須少于109細(xì)胞中所得的，否則將超過密度梯度負(fù)荷量。如果保存液的體積少于20ml，用PH10mMTrisHCL調(diào)至20ml。4．平衡離心管，100000g（SW28轉(zhuǎn)子上為23000rpw）4℃離心90分鐘。5．超凈臺(tái)中取出離心管，用夾子直立固定離心管。6．用10ml移液器從梯度頂部吸去大部分雜質(zhì)。7．在離心管外壁的穿刺點(diǎn)上貼上膠帶，以防止在穿刺過程中有液體泄露。8．用帶18G針頭的5ml注射器從離心管外壁稍低于病毒帶（最下的一條帶）的位置進(jìn)行穿刺。注意：感染性和缺陷性病毒顆粒之間的區(qū)域通常較渾濁，切勿吸取這一渾濁區(qū)。9．小心抽吸病毒帶，避免吸到其它帶和雜質(zhì)，拔出針頭。10．取出針頭，將含病毒的溶液轉(zhuǎn)移至無菌15ml離心管。11．加入1倍體積1TE，這一步對(duì)于把溶液密度降低。連續(xù)密度梯度離心1．使用連續(xù)密度發(fā)生器將12ml和14ml氯化銫連續(xù)密度梯度加入離心管中。2．非常緩慢地在密度梯度頂部加入810ml步中稀釋的病毒懸液。3．100000g4℃離心1620小時(shí)。4．超速離心后，連續(xù)梯度溶液和不連續(xù)梯度溶液同樣分層，但底部沒有沉淀，因此通過底部穿刺即可獲得感染性病毒帶。溶液上部（含細(xì)胞成分）通常更為干凈，大部分細(xì)胞碎片已通過第一步不連續(xù)梯度離心被去除了。5．用10ml移液器從離心管頂部吸去大部分梯度溶液和雜質(zhì)，避免吸到底部含病毒的藍(lán)白色條帶。這有助于在收集病毒時(shí)降低溶液流出速度。6．用20G針頭從底部穿刺收集底部藍(lán)白色病毒帶。7．讓底部梯度溶液流入燒杯，當(dāng)接近病毒帶時(shí)再轉(zhuǎn)入50ml離心管中收集。8．藍(lán)白色病毒帶收集完后再將剩余的梯度溶液轉(zhuǎn)入燒杯。說明：當(dāng)然，病毒帶也可以象不連續(xù)梯度時(shí)一樣從側(cè)壁穿刺收集。病毒溶液去鹽和濃縮氯化銫是通過透析去除的，這一步至關(guān)重要，因?yàn)楦邼舛嚷然C可能會(huì)影響病毒對(duì)細(xì)胞或組織的感染。透析液的選擇取決于病毒的最終用途。如果用于動(dòng)物，則應(yīng)避免使用甘油，因?yàn)楹懈视偷娜芤簶O難注射；如果要使病毒滴度達(dá)到51011vp/ml，則應(yīng)避免PBS5%蔗糖緩沖液，因其不能提供良好的病毒穩(wěn)定性，由于溶液PH的關(guān)系，病毒將會(huì)沉淀下來。含10mMTris（），2mMMgcl2，5%蔗糖的病毒緩沖液可允許病毒濃縮至1013vp/ml，并且具有良好的穩(wěn)定性。（NybergHoffman等，1999）。將病毒帶在分子篩為25000道爾頓的纖維素酯膜中進(jìn)行4℃透析，去除氯化銫鹽。由于病毒分子量較大，大小約90nm，因此不能穿過透析膜。緩沖液的體積應(yīng)為病毒溶液的200倍，每次透析一小時(shí)，然后更換緩沖液，3次更換緩沖液后應(yīng)已無痕量氯化銫。透析后的病毒溶液可在80℃中長期保存，20℃中則可保存較短時(shí)間。需要注意的是腺病毒在反復(fù)凍融后感染力將減弱，因此可將病毒分裝成小份，一部分進(jìn)行滴度測(cè)定（：病毒滴度測(cè)定），剩下的用于以后的實(shí)驗(yàn)。如果透析后病毒溶液太稀，Millipore公司的超純濃集柱可將病毒濃度提高10倍。這個(gè)過程中所丟失的病毒量小于10%。純化柱在使用前必須用70%乙醇消毒，然后在加入病毒前再去除痕量乙醇（比如用病毒緩沖液）。
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