【正文】 培養(yǎng)物和經(jīng)典作為陰性對照，分別取181。置滅菌離心管中，加入181。變性液，混勻。羆醬畝餅謄歿湊鈑繳錙穡鐠。 提取將以處理的樣品依次加入醋酸鈉溶液181。、酚氯仿異戊醇混合液181。，顛倒次混勻，冰浴分鐘，℃離心分鐘。取上清181。置于新的經(jīng)水處理過濾滅菌離心管中，加入等體積異丙醇，混勻，置液氮中分鐘或℃冰箱分鐘。取出樣品管，室溫融化，℃離心分鐘。棄上清，沿管壁緩緩滴入℃預(yù)冷乙醇，輕輕旋轉(zhuǎn)洗一次后倒掉，將離心管倒扣于吸水紙上分鐘，真空干燥分鐘。用181。無酶的滅菌雙蒸水和181。酶抑制劑溶解沉淀?！姹４?zhèn)溆?。鰱診齡師該鈴書銨鴇開孫紗。 反轉(zhuǎn)錄（） 反應(yīng)液體系配置如下：無菌水 181。 181。 引物 181。 倍緩沖液 181。 反轉(zhuǎn)錄酶 181。 酶抑制劑 181。提取的 181?；靹虿⒆龊脴擞洠趦x上進行以下反轉(zhuǎn)錄程序：℃ 分鐘，℃ 分鐘。 操作 反應(yīng)液體系配置如下：無菌水 181。 181。引物和 181。氯化鎂 181。倍緩沖液 181。 聚合酶 181。 181?；靹虿⒆龊脴擞?，加入181。礦物油覆蓋，在儀上進行以下擴增程序：℃秒、℃秒、℃秒，共個循環(huán)；℃延伸分鐘。磚緙鵝綱謾擻鴻鑌紙?zhí)\頦湊。 電泳將擴增產(chǎn)物181?；旌?81。上樣緩沖液，加樣于瓊脂糖凝膠孔中，以電壓電泳分鐘，紫外燈下觀察結(jié)果。鬮煒鰭輥賠還魴隊駝騾詭貲。 結(jié)果判定在陽性對照樣品出現(xiàn)擴增帶、陰性對照樣品無擴增帶出現(xiàn)（引物帶除外）時，實驗結(jié)果成立。病毒培養(yǎng)液出現(xiàn)擴增帶為 株陽性，否則為陰性。畢懍鲅鵑較惻飾顳矯涇煥櫫。、豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體檢測方法 試劑盒豬繁殖與呼吸綜合征（藍耳?。┛贵w酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒，購自北京元亨公司。釓歷駕無醬賠雋驍韉贈三飯。 方法。：稀釋（181。樣品稀釋液181。待檢血清），陰性和陽性對照不稀釋。徠鰹飲臉鑠嘗鏍鯢煬憑鑌脈。，按下圖在記錄表上記錄樣本在孔反應(yīng)板上的位置：在、和、孔加入陽性對照，在、和、孔加入陰性對照，其余孔加入稀釋好的待檢血清，每個樣品加兩孔（和各孔），181。孔。貼上封板膜，置室溫（～℃），孵育分鐘。謂鑷頗銨鋃誼鉸鸚鎘糝蘞堝。陽性陽性樣樣陽性陽性樣樣陰性陰性樣樣陰性陰性樣樣樣樣樣樣樣樣樣樣樣樣，棄去各孔中液體，拍干。向各孔中加滿洗滌工作液，靜置約分鐘，棄去各孔中液體，如此重復(fù)洗滌～次，最后在吸水紙上拍干。變趙隉涼鐓囑釧億殮錙殘釔。，貼上封板膜，置室溫（～℃），孵育分鐘。薈鎣閌漸陸訃輊減鈿異儀猶。，置室溫（～℃），孵育分鐘。輕振混勻，應(yīng)在分鐘內(nèi)，用酶標儀測定650mm波長的值。鵬篩鎬討顓辦費嘆攝虜鈺鴆。，輕振混勻，應(yīng)在分鐘內(nèi)，用酶標儀測定650mm波長的值。糝殞鋦雋駛鶯諑壚輻驄繚覿。 判定，方為有效：陽性對照平均值（175。）陰性對照平均值（175。）≥；陰性對照平均值（175。）≤175。[()()]175。[()()]計算方法 (樣品孔樣品孔) 175。結(jié)果判定≥，判為豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體陽性；＜，判為豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體陰性。、豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原檢測方法 試劑盒北京世紀元亨動物防疫技術(shù)有限公司生產(chǎn)的 檢測試劑盒。 方法按照試劑盒說明書要求進行以下操作。 取已處理的待檢樣品及陰性、陽性對照樣品，每管依次加入181。變性液，醋酸鈉溶液181。，酚氯仿異戊醇混合液181。，顛倒次混勻，冰浴分鐘，℃轉(zhuǎn)分離心分鐘。頜層銖壺鮮儀計堯當(dāng)涇撓惡。 取上清181。置于新的經(jīng)水處理過的滅菌離心管中，加入等體積異丙醇，混勻，置液氮中分鐘或℃冰箱中分鐘。取出離心管，室溫融化，將離心管開口側(cè)朝離心機轉(zhuǎn)軸方向放入離心機內(nèi)，℃。 棄上清，沿離心管開口方向緩緩滴入℃預(yù)冷乙醇，輕輕旋轉(zhuǎn)洗一次后倒掉，將離心管倒扣于吸水紙上分鐘，真空抽干分鐘。銑饜醞貽龍鵠臚擰奧憑軌簍。 用181。無酶的滅菌雙蒸水和181。 酶抑制劑沿離心管開口相反方向溶解沉淀?！鎯Υ?zhèn)溆?。撾鉬轍魘僑絢綰來誄緊糞償。. T擴增總體系為181。每管取反應(yīng)液181。（181。水，181。 ，181。 倍緩沖液，181。 181。上、下游引物混合液），181。 181。 反轉(zhuǎn)錄酶，181。 181。 酶抑制劑，181。 181。 聚合酶，181。提取的樣品?；靹颍骱脴擞?，加入礦物油約181。覆蓋（有熱蓋的擴增儀不用加礦物油）。運行程序為：℃分鐘，℃分鐘；擴增條件為℃秒，℃秒，℃秒，個循環(huán)后；℃延伸分鐘。賒調(diào)軋憊劌髖糾殯縣鍥峽貢。，點樣于瓊脂糖凝膠孔中，以電壓電泳分鐘，用紫外凝膠成像儀觀察結(jié)果。壘羥贖緙嘸竅碭瀋虯異飽樣。 結(jié)果判定當(dāng)陽性對照出現(xiàn)擴增帶、陰性對照未出現(xiàn)目的帶時，實驗結(jié)果成立。被檢樣品出現(xiàn)擴增帶為豬繁殖與呼吸綜合征病毒陽性，未出現(xiàn)擴增帶的樣品判為陰性。釁璉貢釙壘颯狽猙偵虜諶顆。附件：高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗（株）質(zhì)量標準高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗（株） （ ）畝擱謊為尋瓊淶矚腎驄瑤罷。 ，（ ）綿嘮詮櫸異閿欏簫鵡涇嘜囂。本品系用高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒株經(jīng)細胞傳代致弱的株接種細胞，經(jīng)培養(yǎng)后，收獲感染細胞培養(yǎng)液，加入適宜耐熱凍干保護劑，經(jīng)冷凍真空干燥制成。用于預(yù)防高致病性豬繁殖與呼吸綜合征（即：高致病性豬藍耳?。?。騶鴝記蕢戧滲擺絞絎贍閘選?！拘誀睢? 白色海綿狀疏松團塊，易與瓶壁分離。加稀釋液后迅速溶解?！緹o菌檢驗】 按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行檢驗，應(yīng)無菌生長。【支原體檢驗】 按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行檢驗，應(yīng)無支原體生長。【外源病毒檢驗】按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行檢驗，應(yīng)無外源病毒污染?！捐b別檢驗】（）特異性檢驗將疫苗用含％血清的細胞培養(yǎng)液稀釋至，取稀釋好的疫苗毒與在℃下滅活分鐘的豬繁殖與呼吸綜合征病毒特異性陽性血清（血清中和抗體效價應(yīng)不低于︰）等量混合，置℃水浴中作用小時后，接種已長成良好單層、棄去細胞培養(yǎng)液的孔細胞培養(yǎng)板，每個樣品接種個孔，每孔。同時設(shè)正常細胞對照、病毒對照和陰性血清對照。置℃、含培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察日。陽性血清中和孔和正常細胞對照孔應(yīng)不出現(xiàn)，病毒對照孔和陰性血清對照孔應(yīng)出現(xiàn)。現(xiàn)閭襪鎰攆錘惻繕騫凱袞煬。（）病毒基因鑒定應(yīng)用下列引物（：′′；：′′）對疫苗毒和親本株強毒進行檢測，疫苗毒應(yīng)可擴增出約的特異性條帶，而親本株強毒應(yīng)可擴增出約的特異性條帶。詳細鑒別方法見附注。鐨輝藺敘檔檻豈藶禍緊潔鯨?！景踩珯z驗】用～周齡健康易感（附注）仔豬頭，各頸部肌肉注射疫苗頭份，每日測溫并連續(xù)觀察日。應(yīng)不出現(xiàn)由疫苗引起的局部和全身不良反應(yīng)，且體溫應(yīng)不超過℃。詳細的動物體溫測定法見附注。梟裥蕎獰淪鉦壚蝕頸鍥儲蠍。【效力檢驗】（）病毒含量測定將疫苗用含血清的細胞培養(yǎng)液稀釋成頭份，再作倍系列稀釋，取、個稀釋度，分別接種于已長成良好單層、棄去培養(yǎng)液的孔細胞培養(yǎng)板，每個稀釋度接種孔，每孔，同時設(shè)正常細胞對照組。置℃、含培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察日，用法計算。每頭份疫苗病毒含量應(yīng)不低于。輟紺腦誒瀅摟廚議犧異銖張。（）免疫攻毒法用～周齡健康易感（附注）仔豬頭，隨機分成組，每組頭。一組各頸部肌肉注射疫苗頭份，另一組不接種疫苗，作為對照，在相同條件下隔離飼養(yǎng)。日后，所有豬各滴鼻接種檢驗用強毒株的病毒培養(yǎng)液（～），每日測溫并觀察日。對照豬均應(yīng)發(fā)病（發(fā)病豬判定標準見附注），且至少頭死亡，免疫豬應(yīng)至少頭保護。屢潯繾飛獼轄黨諑鐙虜膠錆?！臼Ｓ嗨譁y定】 按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行測定，應(yīng)符合獸用生物制品通則的規(guī)定。【真空度測定】 按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行測定，應(yīng)符合規(guī)定?！疽?guī)格】 （）頭份瓶（）頭份瓶（）頭份瓶【貯存與有效期】 ～℃保存，有效期為個月。附注 病毒基因鑒定法 株基因序列存在連續(xù)個核苷酸的缺失，該缺失可作為 株特征性遺傳標記。根據(jù)該缺失部位設(shè)計合成了特異性引物，建立了高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗（株）鑒別檢驗方法。 株經(jīng)該引物序列擴增后可得到約的特異性條帶， 強毒株和其他美洲型強毒株擴增后，均可得到約的特異性條帶。具體方法如下：詔弒緇峴瞼慫龜貯溈驏斕窮。 材料。 株～代細胞培養(yǎng)毒。：′′；下游引物：′′。鳧沖經(jīng)糧籩賂雞軀鎧潔鵜傘。、異丙醇、乙醇等均為分析純； 、酶抑制劑；；酶、等。聰駘縶轤終實騭邏顯贍輾諺。 方法 疫苗毒處理用無菌生理鹽水將疫苗稀釋成頭份。取稀釋好的疫苗液μ，置 水處理的滅菌離心管中。鯧鋱竊鴇緶諏顫鉆邇凱終殺。 強毒株樣品處理取 株代細胞培養(yǎng)毒μ，置 水處理的滅菌離心管中。堿賢矯攝膽嘮闊銻愷緊弳韻。 陰性對照處理取滅菌去離子水μ，置于 水處理的滅菌離心管中。闋蘆畫腎藎覺鎪鐿賚鍥驛縛。 取已處理的疫苗毒、強毒株和陰性對照，分別加入 裂解液μ，混勻，置室溫下分鐘。溝礬爺銦蟈剛銪霽寧棄貝嚨。 在上述離心管中分別加入氯仿μ，蓋好蓋子，劇烈搖晃秒之后，在～℃下放置～分鐘，在 ～℃下以離心分鐘。鈣槍濾黨許蕁鄶飫?wù)a慮瞇輻。 將水層小心移入一新的水處理的離心管中，分別加入異丙醇μ，在～℃下放置分鐘，在～℃下以離心分鐘。懌處濁渾誹買躦騸嗆驏壘濕。 棄上清，加入％乙醇μ，在～℃下以至少離心分鐘。謝齒毀覽賬繰財鱗蠼潔陝鱟。 棄％乙醇，空氣中干燥～分鐘。加入水μ重新溶解。吶韋楨闔踐鴟諍齏蘭贍讓蘄。（）總反應(yīng)體系為μ。 取每份樣品的 μ，置離心管中，加入引物μ，混勻，置℃水浴中作用分鐘，取出，再冰浴～分鐘。萊酈晉壩辭終裥俠輿擊潰嶁。 加入 μ， 倍反轉(zhuǎn)錄緩沖液μ， 反轉(zhuǎn)錄酶μ，酶抑制劑μ，水μ，混勻，置℃水浴中作用小時。鷲詛撿瞇釵騭蓀剝黃縶別鏟。 擴增總反應(yīng)體系為μ。 反應(yīng)體系 μ, 倍 μ, μ, μ上游引物μ, μ下游引物μ, 聚合酶μ，加入雙蒸水μ。紉綰懔賬鍘禪耬啞綿鍇鋃碩。 擴增℃預(yù)變性分鐘；℃變性秒，℃退火分鐘，℃延伸秒，個循環(huán)；℃延伸分鐘。顢燦懺騅錳顆繡奪鮪棄蔦麗。，加入倍電泳緩沖液，置于微波爐中加熱溶解，加入μ染色液混勻，在電泳槽內(nèi)放好梳子，倒入瓊脂糖凝膠，待凝固。取擴增產(chǎn)物μ，加入倍上樣緩沖液μ，點樣于瓊脂糖凝膠孔中，在恒壓下電泳分鐘后，置紫外燈下觀察結(jié)果。潛憒巔懟閑貓簡巒競慮棧諾。 結(jié)果判定 豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗毒（株）可擴增出約的特異性條帶，強毒株～代細胞培養(yǎng)毒應(yīng)可擴增出約的特異性條帶，陰性對照應(yīng)無擴增帶出現(xiàn)（引物帶除外）。鏟卻審緒韃聞癬惱颯驏齡攖。 健康易感豬標準 健康易感豬系指經(jīng)豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測試劑盒檢測為抗原陰性、豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體檢測試劑盒檢測為抗體陰性的豬。擄鱘殼郟餳渦爛摻璽灑鄆際。 豬繁殖與呼吸綜合征病毒 檢測按照農(nóng)業(yè)部公告第號發(fā)布的豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測試劑盒說明書進行。當(dāng)陽性對照出現(xiàn)約擴增帶、陰性對照無擴增帶出現(xiàn)（引物帶除外）時，實驗結(jié)果成立。被檢樣品出現(xiàn)約擴增帶時為豬繁殖與呼吸綜合征病毒核酸陽性，未出現(xiàn)相應(yīng)擴增帶時為陰性。贗鐨嚳齬騏銻潑櫟聞贏繃綢。 豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體檢測按照農(nóng)業(yè)部公告第號發(fā)布的豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體檢測試劑盒說明書進行。當(dāng) ≥時，判為豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體陽性；當(dāng)＜時，判為豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體陰性。殼贈嘆橈鯛槳櫨滄滸擊懼廄。 動物體溫測定法 測定方法 每日定時測定豬的直腸溫度。應(yīng)在獸用體溫計末端系一條長～15cm的細繩，在細繩的另一端系一個小鐵夾。每日上午點至點之間，飼喂動物時進行體溫測定，測定體溫時應(yīng)先將水銀柱甩至℃刻度線以下，并對體溫計用酒精棉球、碘酊進行消毒，涂少許潤滑劑；一只手拉住豬的尾巴，另一手持體溫計沿稍微偏向背側(cè)的方向插入其肛門內(nèi)，再用小鐵夾夾往豬尾根上方的毛以固定體溫計?！昼姾笕〕鲶w溫計，用酒精棉球?qū)⑵洳羶?，迅速讀出體溫數(shù)。襉藍動蔭鶚鈑掙濰鋱縶魯軛。 判定標準 應(yīng)不超過℃。 注意事項 對剛經(jīng)過劇烈運動的豬測量體溫時，應(yīng)待豬作適當(dāng)休息后再進行測溫；對性情溫馴的豬測量體溫時，可先用手指輕輕搔其后背部，待安靜站立或臥地后，再將體溫計插入直腸；對兇暴或騷動不安的豬，應(yīng)作適當(dāng)安定后再進行測溫；在對初生乳豬測量體溫時，體溫計不可插入肛門過深，要用手抓住體溫計末端進行固定。傘箋內(nèi)鍶樂撈憶瓊檸鍇賕澮。 發(fā)病豬判定標準 至少日體溫在℃以上；或出現(xiàn)精神食欲下降，眼結(jié)膜炎，咳嗽、喘等呼吸道癥狀。 大體剖檢，肺部出現(xiàn)片狀實變。符合以上條，即可判為發(fā)病。高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗（株）說明書【獸藥名稱】通用名 高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗（株）商品名 破思靈英文名 ，（）緬殲傷卻兗輔宮礡釅棄稈騅。漢語拼音 （ ） 驪嘗叢煙協(xié)彈嚕約戲虛嫻蒞?！局饕煞峙c含量】 每頭份疫苗含高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒至少?！拘誀睢? 乳白色疏松團塊，易于瓶壁脫離，加稀釋液后迅速溶解?！咀饔门c用途】 用于預(yù)防高致