【正文】 錄 。 志賀氏菌診斷血清C3 檢驗程序20 / 28檢驗程序見圖 C。C4 操作步驟 樣品處理和增菌培養(yǎng) 污水取 200mL 污水，用滅菌濾膜進行抽濾。用 100mL 二倍濃度 GN 增菌液把濾膜上截留的雜質(zhì)洗脫到已滅菌的三角燒瓶內(nèi)，搖勻，置于 37℃恒溫培養(yǎng)箱，增菌培養(yǎng) 6～8h。注：若樣品為經(jīng)過氯消毒的污水，應在采樣后立即用 5％硫代硫酸鈉溶液充分中和余氯。 污泥取污泥 30g，放入滅菌容器內(nèi)，加入 300mL 滅菌水，充分混勻制成 1：10 混懸液。吸取上述 1：10 混懸液 100mL，加入到裝有 100mL 二倍濃度 GN 增菌液的已滅菌的三角燒瓶內(nèi)，攪勻，置于 37℃恒溫培養(yǎng)箱中，增菌培養(yǎng) 6～8h。注：若樣品為經(jīng)過氯消毒的污泥，應在采樣后立即用 5％硫代硫酸鈉溶液充分中和余氯。 分離取上述增菌培養(yǎng)液，分別接種 SS 培養(yǎng)基平板和 EMB 培養(yǎng)基平板，置于 37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h。挑取在 SS 培養(yǎng)基平板和 EMB 培養(yǎng)基平板上呈無色透明，直徑 1～ 的可疑腸道病原菌菌落。每個平板最少挑取 5 個菌落，接種于 TSI 培養(yǎng)基，置于 37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h。 挑取在 TSI 中，葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，無動力，不產(chǎn)生硫化氫，上層斜面乳糖不分解的菌株，可做血清學和生化試驗。 鑒定 血清學試驗 圖 C 污 水 、 污 泥 中 志 賀 氏 菌 檢 驗 程 序 增 菌 ： 將 樣 品 接 種 于 雙 倍 濃 度 GN 平 板 分 離 ： 挑 選 可 疑 菌 落 接 種 于 TSI 鑒 定 ： 生 化 、 血 清 學 試 驗 檢 驗 結(jié) 果 報 告 平 板 分 離 ： 將 增 菌 培 養(yǎng) 液 分 別 接 種 于 S和 EMB 37℃ 、 6～ 8h培 養(yǎng) 37℃ 、 培 養(yǎng) 24h 37℃ 、 培 養(yǎng) 18～ 24h 污 水 樣 品 處 理 ： 過 濾 污 水 樣 品 處 理 ： 稀 釋 21 / 28志賀氏菌屬分為四個群，先與多價血清作玻璃片凝集試驗，如為陽性，再分別與A、B、C、D 群血清凝集，并進一步與分型血清做玻璃片凝集，最后確定其血清型。 生化試驗應進行葡萄糖、甘露醇、麥芽糖、乳糖、蔗糖、靛基質(zhì)、硫化氫、動力、尿素試驗。志賀氏菌屬能分解葡萄糖，但不產(chǎn)氣(福氏志賀氏菌 6 型有時產(chǎn)生少量氣體)，一般不能分解乳糖和蔗糖，宋內(nèi)氏志賀氏菌對乳糖和蔗糖遲緩發(fā)酵產(chǎn)酸。志賀氏菌屬均不產(chǎn)生硫化氫，不分解尿素，無動力。對甘露醇、麥芽糖的發(fā)酵及靛基質(zhì)的產(chǎn)生，則因菌株不同而異。如遇多價血清玻璃片凝集試驗為陰性，而生化反應符合上述情況時，可加做肌醇、水楊酸、VP、櫞酸鹽、氰化鉀等試驗。志賀氏菌屬均為陰性反應。C5 檢驗結(jié)果報告根據(jù)檢驗結(jié)果，報告一定體積的樣品中存在或不存在志賀氏菌。附錄 D(標準的附錄)醫(yī)療機構(gòu)污泥中蛔蟲卵的檢驗方法D1 儀器和設備 離心機。 金屬篩：60 目。 顯微鏡。 恒溫培養(yǎng)箱。 高壓蒸汽滅菌器。 冰箱。 振蕩器。D2 培養(yǎng)基和試劑 3%福爾馬林溶液或 3%鹽酸溶液 飽和硝酸鈉溶液（比重 ～）或飽和氯化鈉溶液 30%次氯酸鈉溶液D3 檢驗程序蛔蟲卵檢驗程序見圖 D。 圖 D 污 泥 中 蛔 蟲 卵 檢 驗 程 序 蛔 蟲 卵 收 集 （ 漂 浮 ） ： 加 飽 和 硝 酸 鈉 溶 液 離 心 蛔 蟲 卵 收 集 （ 沉 淀 ） ： 加 蒸 餾 水 離 心 檢 驗 結(jié) 果 報 告 蛔 蟲 卵 收 集 （ 分 離 ） ： 加 氫 氧 化 鈉 溶 液 振 蕩 培 養(yǎng) 鏡 檢 ： 生 死 蟲 卵 數(shù) 蛔 蟲 卵 收 集 （ 水 洗 ） ： 加 蒸 餾 水 離 心 倒 去 上 清 液 吸 取 上 層 浮 膜 22 / 28D4 操作步驟 采樣及樣品處理樣品采集后應立即送到實驗室檢驗。若不能立即檢驗時，可在 100g 污泥中加入 5mL3%福爾馬林或 3%鹽酸溶液，在 4～10℃冰箱內(nèi)保存。若樣品為經(jīng)過氯消毒的污泥，應在現(xiàn)場取樣后立即用 5％硫代硫酸鈉溶液充分中和余氯。 蛔蟲卵收集 分離將 100g 污泥樣品和 50mL5％氫氧化鈉溶液，分別注入三角燒杯內(nèi)，置于振蕩器上，以 200～300 次/min 速度振蕩 30min，然后靜置 30min，以使蛔蟲卵不再粘附在污泥上。 水洗將上述樣品分裝在離心管內(nèi)，以 2022～2500 轉(zhuǎn)/min 的轉(zhuǎn)速離心 5min。倒去離心管上部的液體，加入容量為沉淀物 10 倍的蒸餾水，混勻，以 2022～2500 轉(zhuǎn)/min 的轉(zhuǎn)速離心5min，如此反復數(shù)次，直至沉淀物上面的液體接近透明。 漂浮離心管內(nèi)注入飽和硝酸鈉溶液或飽和氯化鈉溶液，攪勻，以 2022～2500 轉(zhuǎn)/min 的轉(zhuǎn)速離心 5min。注 1：由于蛔蟲卵的相對密度小于飽和硝酸鈉溶液和飽和氯化鈉溶液的相對密度，管內(nèi)絕大多數(shù)的蛔蟲卵會浮聚在液面上。注 2：氯化鈉溶液投加量以大于沉淀物量 20 倍為宜。注 3：根據(jù)污泥性狀，可以調(diào)整離心轉(zhuǎn)速或時間。 沉淀反復吸取管中浮膜轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入 10 倍水量的蒸餾水，攪勻，以 5000 轉(zhuǎn)/min 的轉(zhuǎn)速離心 5min，慢慢吸去上清液。注：由于蛔蟲卵比水的相對密度大，蛔蟲卵將沉在管底內(nèi)。 培養(yǎng)在離心管中，加入 2～3mL 無菌的生理鹽水或自來水和幾滴 3％福爾馬林溶液，搖勻，轉(zhuǎn)移至試管或直接置于 24～26℃恒溫箱，培養(yǎng) 20 天。培養(yǎng)中，若溶液量少于 2mL 時，應及時補充生理鹽水或自來水。 鏡檢培養(yǎng)后，將樣品靜置 30mL 后吸去試管內(nèi)上層較渾濁的液體，加入約為沉淀物兩倍量的蒸餾水或 30％次氯酸鈉溶液，混勻，在顯微鏡下計數(shù)死活蛔蟲卵數(shù)。注 1：活蟲卵經(jīng)過 20 天的培養(yǎng)會逐漸發(fā)育到幼蟲期，而死蟲卵則在同一條件下仍然保持單細胞期或停留于某一發(fā)育階段，故可以區(qū)別。注 2：30％次氯酸鈉溶液能使蟲卵最外層蛋白質(zhì)殼逐漸溶解，便于在顯微鏡下清晰觀察卵內(nèi)的幼蟲。D5 蛔蟲卵死亡率計算按下式計算蛔蟲卵死亡率： 10???nmA公式中：A——蛔蟲卵死亡率（%） ； m——死亡蛔蟲卵數(shù)；23 / 28 n——存活蛔蟲卵數(shù)D6 檢驗結(jié)果報告根據(jù)檢驗結(jié)果，報告 100g 污泥中蛔蟲卵死亡率。附錄 E(規(guī)范性附錄) 醫(yī)療機構(gòu)污水和污泥中結(jié)核桿菌的檢驗方法E1 儀器和設備 電爐。 恒溫水浴箱。 高壓蒸汽滅菌器。 濾菌器。 離心機。 恒溫培養(yǎng)箱。 乙酸纖維膜：孔徑為 ～ 玻璃漏斗 G2：孔徑為 10～15μm 玻璃漏斗 G4：孔徑為 3～4μm 酒精燈E2 培養(yǎng)基和試劑： 改良羅氏培養(yǎng)基 成分磷酸二氫鉀 硫酸鎂 枸櫞酸鎂 谷氨酸鈉 甘油 12mL淀粉 30g蒸餾水 600mL雞蛋液（包括蛋清和蛋黃） 1000mL20%孔雀綠 20mL 制法將磷酸二氫鉀、硫酸鎂、枸櫞酸鈉、谷氨酸鈉、甘油及蒸餾水混合于燒杯內(nèi)，放在沸水浴中加熱溶解。加入淀粉繼續(xù)加熱 1h，搖動使其溶解，待冷卻至 50℃加雞蛋液及孔雀綠，溶解，混勻。制成斜面，保持溫度 90℃，滅菌 1h。 小川氏培養(yǎng)基 成分甲液：無水磷酸二氫鉀 1g 味精 1g 蒸餾水 100mL乙液：全蛋液 200mL 甘油 6mL 2%孔雀綠 6mL 制法 甲、乙兩液混合分裝試管內(nèi)。制成斜面，保持溫度 90℃滅菌 1 h。 pH 為 的磷酸鹽緩沖液(M／15)24 / 28 10％吐溫(Tween)80 水溶液加等量 30％過氧化氫溶液。 4％硫酸溶液E3 檢驗程序結(jié)核桿菌檢驗程序見圖 E。E4 操作步驟 集菌污水集菌可采用過濾離心法或直接離心法,污泥集菌可采用過濾離心法。 污水樣品 過濾離心法：用經(jīng)煮沸消毒的乙酸纖維濾膜(孔徑 ～)抽濾，安裝嚴密后，取污水樣 500mL 抽濾，根據(jù)懸浮物的多少，一份水樣需更換數(shù)張濾膜，將同—份水樣濾膜集中于小燒杯內(nèi)。根據(jù)濾膜的多少用 100～200mL4％硫酸溶液反復沖洗，靜置 30min 后，收集洗液于離心管中，3000 轉(zhuǎn)／min，離心 30min，棄去上清液，沉淀物中加 1mL 滅菌生理鹽水混合均勻后，供接種用。直接離心法：水樣 500mL，分裝于 50mL 或 200mL 滅菌離心管中，3000 轉(zhuǎn)／min，離心30min。同一份水樣的沉淀物集中于試管內(nèi)，加等量 4％硫酸處理 30min，供接種用。如體積過大，再次離心濃縮后接種。注：若樣品為經(jīng)過氯消毒的污水，應在采樣后立即用 5％硫代硫酸鈉溶液充分中和余氯。 污泥樣品過濾離心法：取污泥 10g 加 100mL 蒸餾水沖洗過濾(濾紙漏斗)，再經(jīng)玻璃漏斗 G2(孔徑 10～15μm)和 G4(孔徑 3～4μm)抽濾，最后經(jīng)濾膜(孔徑 ～)抽濾。取下濾膜，用 4%硫酸 3mL，充分振搖沖洗 30min。注：若樣品為經(jīng)過氯消毒的污泥，應在采樣后立即用 5％硫代硫酸鈉溶液充分中和余氯。 接種污水的集菌液：全部接種于改良羅氏培養(yǎng)基或小川氏培養(yǎng)基培養(yǎng)管內(nèi)斜面上，每支培養(yǎng)管接種 。污泥的集菌液：吸取兩個 ，分別接種于改良羅氏培養(yǎng)基或小川氏培養(yǎng)基培養(yǎng)管 圖 E 結(jié) 核 桿 菌 檢 驗 程 序 初 步 鑒 定 ： 對 可 疑 菌 落 作 抗 酸 染 色 ， 染 色 陽 性 者 再 作 分 離 傳 代 鑒 定 ： 致 病 力 試 驗 檢 驗 結(jié) 果 報 告 培 養(yǎng) ： 接 種 于 羅 氏 培 養(yǎng) 基 或 小 川 氏 培 養(yǎng) 基 37℃ 、 培 養(yǎng) 8周 28℃ 、 培 養(yǎng) 2～ 4周 污 水 集 菌 ： 過 濾 離 心 法 或 直 接 離 心 法 污 泥 集 菌 ： 過 濾 離 心 法 25 / 28內(nèi)斜面上。 培養(yǎng)已接種的培養(yǎng)基置于 37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng) 2 周后開始觀察結(jié)果，每周觀察 2 次。一般需要培養(yǎng) 8 周。 分離菌株：在羅氏培養(yǎng)基上呈淡黃色或無色的粗糙型菌落，作抗酸染色，陽性者作分離傳代。分離傳代菌株如生長速度在兩周以上，則需作菌型鑒定；應用耐熱觸酶試驗和傳代培養(yǎng)于 28℃培養(yǎng) 2～4 周，觀察是否生長，用此方法即可進行初步鑒定。 致病力試驗 耐熱觸酶反應陰性，28℃不生長之菌落為可疑結(jié)核桿菌。于小白鼠尾靜脈接種 lmg 菌量(5mg／mL 菌液，每只動物接種 )，死亡時觀察病變或 8 周后解剖臟器發(fā)現(xiàn)典型結(jié)核病變者可確認為檢出結(jié)核桿菌。其耐熱觸酶試驗方法如下： 取菌落 3～5 mg 分散于 磷酸鹽緩沖液中，置 68℃水浴中 20min 后取出．冷卻后加吐溫 80h 和過氧化氫溶液混合液 。 發(fā)生氣泡為陽性，30min 不產(chǎn)生氣泡者為陰性。人型、牛型結(jié)核桿菌，胃分枝桿菌和海魚分枝桿菌為陰性，其他非典型抗酸菌和非致病抗酸菌為陽性。人型、牛型結(jié)核桿菌在28℃培養(yǎng)不生長，胃分枝桿菌和海魚分枝桿菌 28℃培養(yǎng)能生長。E5 檢驗結(jié)果報告根據(jù)檢驗結(jié)果，報告一定體積的樣品中存在或不存在結(jié)核桿菌。附錄 F(規(guī)范性附錄)醫(yī)療機構(gòu)污水污染物（COD、BOD、SS）單位排放負荷計算方法F1 水污染物單位排放負荷計算公式：L= CQ/N式中：L水污染物排放單位負荷（g/ ）C污染物排放濃度（mg/L）Q日排水量（m 3/ d）N床位數(shù)（床