【正文】 錄 。 志賀氏菌診斷血清C3 檢驗(yàn)程序20 / 28檢驗(yàn)程序見圖 C。C4 操作步驟 樣品處理和增菌培養(yǎng) 污水取 200mL 污水，用滅菌濾膜進(jìn)行抽濾。用 100mL 二倍濃度 GN 增菌液把濾膜上截留的雜質(zhì)洗脫到已滅菌的三角燒瓶內(nèi)，搖勻，置于 37℃恒溫培養(yǎng)箱，增菌培養(yǎng) 6～8h。注：若樣品為經(jīng)過氯消毒的污水，應(yīng)在采樣后立即用 5％硫代硫酸鈉溶液充分中和余氯。 污泥取污泥 30g，放入滅菌容器內(nèi)，加入 300mL 滅菌水，充分混勻制成 1：10 混懸液。吸取上述 1：10 混懸液 100mL，加入到裝有 100mL 二倍濃度 GN 增菌液的已滅菌的三角燒瓶內(nèi)，攪勻，置于 37℃恒溫培養(yǎng)箱中，增菌培養(yǎng) 6～8h。注：若樣品為經(jīng)過氯消毒的污泥，應(yīng)在采樣后立即用 5％硫代硫酸鈉溶液充分中和余氯。 分離取上述增菌培養(yǎng)液，分別接種 SS 培養(yǎng)基平板和 EMB 培養(yǎng)基平板，置于 37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h。挑取在 SS 培養(yǎng)基平板和 EMB 培養(yǎng)基平板上呈無色透明，直徑 1～ 的可疑腸道病原菌菌落。每個(gè)平板最少挑取 5 個(gè)菌落，接種于 TSI 培養(yǎng)基，置于 37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h。 挑取在 TSI 中，葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，無動(dòng)力，不產(chǎn)生硫化氫，上層斜面乳糖不分解的菌株，可做血清學(xué)和生化試驗(yàn)。 鑒定 血清學(xué)試驗(yàn) 圖 C 污 水 、 污 泥 中 志 賀 氏 菌 檢 驗(yàn) 程 序 增 菌 ： 將 樣 品 接 種 于 雙 倍 濃 度 GN 平 板 分 離 ： 挑 選 可 疑 菌 落 接 種 于 TSI 鑒 定 ： 生 化 、 血 清 學(xué) 試 驗(yàn) 檢 驗(yàn) 結(jié) 果 報(bào) 告 平 板 分 離 ： 將 增 菌 培 養(yǎng) 液 分 別 接 種 于 S和 EMB 37℃ 、 6～ 8h培 養(yǎng) 37℃ 、 培 養(yǎng) 24h 37℃ 、 培 養(yǎng) 18～ 24h 污 水 樣 品 處 理 ： 過 濾 污 水 樣 品 處 理 ： 稀 釋 21 / 28志賀氏菌屬分為四個(gè)群，先與多價(jià)血清作玻璃片凝集試驗(yàn)，如為陽性，再分別與A、B、C、D 群血清凝集，并進(jìn)一步與分型血清做玻璃片凝集，最后確定其血清型。 生化試驗(yàn)應(yīng)進(jìn)行葡萄糖、甘露醇、麥芽糖、乳糖、蔗糖、靛基質(zhì)、硫化氫、動(dòng)力、尿素試驗(yàn)。志賀氏菌屬能分解葡萄糖，但不產(chǎn)氣(福氏志賀氏菌 6 型有時(shí)產(chǎn)生少量氣體)，一般不能分解乳糖和蔗糖，宋內(nèi)氏志賀氏菌對(duì)乳糖和蔗糖遲緩發(fā)酵產(chǎn)酸。志賀氏菌屬均不產(chǎn)生硫化氫，不分解尿素，無動(dòng)力。對(duì)甘露醇、麥芽糖的發(fā)酵及靛基質(zhì)的產(chǎn)生，則因菌株不同而異。如遇多價(jià)血清玻璃片凝集試驗(yàn)為陰性，而生化反應(yīng)符合上述情況時(shí)，可加做肌醇、水楊酸、VP、櫞酸鹽、氰化鉀等試驗(yàn)。志賀氏菌屬均為陰性反應(yīng)。C5 檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告根據(jù)檢驗(yàn)結(jié)果，報(bào)告一定體積的樣品中存在或不存在志賀氏菌。附錄 D(標(biāo)準(zhǔn)的附錄)醫(yī)療機(jī)構(gòu)污泥中蛔蟲卵的檢驗(yàn)方法D1 儀器和設(shè)備 離心機(jī)。 金屬篩：60 目。 顯微鏡。 恒溫培養(yǎng)箱。 高壓蒸汽滅菌器。 冰箱。 振蕩器。D2 培養(yǎng)基和試劑 3%福爾馬林溶液或 3%鹽酸溶液 飽和硝酸鈉溶液（比重 ～）或飽和氯化鈉溶液 30%次氯酸鈉溶液D3 檢驗(yàn)程序蛔蟲卵檢驗(yàn)程序見圖 D。 圖 D 污 泥 中 蛔 蟲 卵 檢 驗(yàn) 程 序 蛔 蟲 卵 收 集 （ 漂 浮 ） ： 加 飽 和 硝 酸 鈉 溶 液 離 心 蛔 蟲 卵 收 集 （ 沉 淀 ） ： 加 蒸 餾 水 離 心 檢 驗(yàn) 結(jié) 果 報(bào) 告 蛔 蟲 卵 收 集 （ 分 離 ） ： 加 氫 氧 化 鈉 溶 液 振 蕩 培 養(yǎng) 鏡 檢 ： 生 死 蟲 卵 數(shù) 蛔 蟲 卵 收 集 （ 水 洗 ） ： 加 蒸 餾 水 離 心 倒 去 上 清 液 吸 取 上 層 浮 膜 22 / 28D4 操作步驟 采樣及樣品處理樣品采集后應(yīng)立即送到實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)。若不能立即檢驗(yàn)時(shí)，可在 100g 污泥中加入 5mL3%福爾馬林或 3%鹽酸溶液，在 4～10℃冰箱內(nèi)保存。若樣品為經(jīng)過氯消毒的污泥，應(yīng)在現(xiàn)場取樣后立即用 5％硫代硫酸鈉溶液充分中和余氯。 蛔蟲卵收集 分離將 100g 污泥樣品和 50mL5％氫氧化鈉溶液，分別注入三角燒杯內(nèi)，置于振蕩器上，以 200～300 次/min 速度振蕩 30min，然后靜置 30min，以使蛔蟲卵不再粘附在污泥上。 水洗將上述樣品分裝在離心管內(nèi)，以 2022～2500 轉(zhuǎn)/min 的轉(zhuǎn)速離心 5min。倒去離心管上部的液體，加入容量為沉淀物 10 倍的蒸餾水，混勻，以 2022～2500 轉(zhuǎn)/min 的轉(zhuǎn)速離心5min，如此反復(fù)數(shù)次，直至沉淀物上面的液體接近透明。 漂浮離心管內(nèi)注入飽和硝酸鈉溶液或飽和氯化鈉溶液，攪勻，以 2022～2500 轉(zhuǎn)/min 的轉(zhuǎn)速離心 5min。注 1：由于蛔蟲卵的相對(duì)密度小于飽和硝酸鈉溶液和飽和氯化鈉溶液的相對(duì)密度，管內(nèi)絕大多數(shù)的蛔蟲卵會(huì)浮聚在液面上。注 2：氯化鈉溶液投加量以大于沉淀物量 20 倍為宜。注 3：根據(jù)污泥性狀，可以調(diào)整離心轉(zhuǎn)速或時(shí)間。 沉淀反復(fù)吸取管中浮膜轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入 10 倍水量的蒸餾水，攪勻，以 5000 轉(zhuǎn)/min 的轉(zhuǎn)速離心 5min，慢慢吸去上清液。注：由于蛔蟲卵比水的相對(duì)密度大，蛔蟲卵將沉在管底內(nèi)。 培養(yǎng)在離心管中，加入 2～3mL 無菌的生理鹽水或自來水和幾滴 3％福爾馬林溶液，搖勻，轉(zhuǎn)移至試管或直接置于 24～26℃恒溫箱，培養(yǎng) 20 天。培養(yǎng)中，若溶液量少于 2mL 時(shí)，應(yīng)及時(shí)補(bǔ)充生理鹽水或自來水。 鏡檢培養(yǎng)后，將樣品靜置 30mL 后吸去試管內(nèi)上層較渾濁的液體，加入約為沉淀物兩倍量的蒸餾水或 30％次氯酸鈉溶液，混勻，在顯微鏡下計(jì)數(shù)死活蛔蟲卵數(shù)。注 1：活蟲卵經(jīng)過 20 天的培養(yǎng)會(huì)逐漸發(fā)育到幼蟲期，而死蟲卵則在同一條件下仍然保持單細(xì)胞期或停留于某一發(fā)育階段，故可以區(qū)別。注 2：30％次氯酸鈉溶液能使蟲卵最外層蛋白質(zhì)殼逐漸溶解，便于在顯微鏡下清晰觀察卵內(nèi)的幼蟲。D5 蛔蟲卵死亡率計(jì)算按下式計(jì)算蛔蟲卵死亡率： 10???nmA公式中：A——蛔蟲卵死亡率（%） ； m——死亡蛔蟲卵數(shù)；23 / 28 n——存活蛔蟲卵數(shù)D6 檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告根據(jù)檢驗(yàn)結(jié)果，報(bào)告 100g 污泥中蛔蟲卵死亡率。附錄 E(規(guī)范性附錄) 醫(yī)療機(jī)構(gòu)污水和污泥中結(jié)核桿菌的檢驗(yàn)方法E1 儀器和設(shè)備 電爐。 恒溫水浴箱。 高壓蒸汽滅菌器。 濾菌器。 離心機(jī)。 恒溫培養(yǎng)箱。 乙酸纖維膜：孔徑為 ～ 玻璃漏斗 G2：孔徑為 10～15μm 玻璃漏斗 G4：孔徑為 3～4μm 酒精燈E2 培養(yǎng)基和試劑： 改良羅氏培養(yǎng)基 成分磷酸二氫鉀 硫酸鎂 枸櫞酸鎂 谷氨酸鈉 甘油 12mL淀粉 30g蒸餾水 600mL雞蛋液（包括蛋清和蛋黃） 1000mL20%孔雀綠 20mL 制法將磷酸二氫鉀、硫酸鎂、枸櫞酸鈉、谷氨酸鈉、甘油及蒸餾水混合于燒杯內(nèi)，放在沸水浴中加熱溶解。加入淀粉繼續(xù)加熱 1h，搖動(dòng)使其溶解，待冷卻至 50℃加雞蛋液及孔雀綠，溶解，混勻。制成斜面，保持溫度 90℃，滅菌 1h。 小川氏培養(yǎng)基 成分甲液：無水磷酸二氫鉀 1g 味精 1g 蒸餾水 100mL乙液：全蛋液 200mL 甘油 6mL 2%孔雀綠 6mL 制法 甲、乙兩液混合分裝試管內(nèi)。制成斜面，保持溫度 90℃滅菌 1 h。 pH 為 的磷酸鹽緩沖液(M／15)24 / 28 10％吐溫(Tween)80 水溶液加等量 30％過氧化氫溶液。 4％硫酸溶液E3 檢驗(yàn)程序結(jié)核桿菌檢驗(yàn)程序見圖 E。E4 操作步驟 集菌污水集菌可采用過濾離心法或直接離心法,污泥集菌可采用過濾離心法。 污水樣品 過濾離心法：用經(jīng)煮沸消毒的乙酸纖維濾膜(孔徑 ～)抽濾，安裝嚴(yán)密后，取污水樣 500mL 抽濾，根據(jù)懸浮物的多少，一份水樣需更換數(shù)張濾膜，將同—份水樣濾膜集中于小燒杯內(nèi)。根據(jù)濾膜的多少用 100～200mL4％硫酸溶液反復(fù)沖洗，靜置 30min 后，收集洗液于離心管中，3000 轉(zhuǎn)／min，離心 30min，棄去上清液，沉淀物中加 1mL 滅菌生理鹽水混合均勻后，供接種用。直接離心法：水樣 500mL，分裝于 50mL 或 200mL 滅菌離心管中，3000 轉(zhuǎn)／min，離心30min。同一份水樣的沉淀物集中于試管內(nèi)，加等量 4％硫酸處理 30min，供接種用。如體積過大，再次離心濃縮后接種。注：若樣品為經(jīng)過氯消毒的污水，應(yīng)在采樣后立即用 5％硫代硫酸鈉溶液充分中和余氯。 污泥樣品過濾離心法：取污泥 10g 加 100mL 蒸餾水沖洗過濾(濾紙漏斗)，再經(jīng)玻璃漏斗 G2(孔徑 10～15μm)和 G4(孔徑 3～4μm)抽濾，最后經(jīng)濾膜(孔徑 ～)抽濾。取下濾膜，用 4%硫酸 3mL，充分振搖沖洗 30min。注：若樣品為經(jīng)過氯消毒的污泥，應(yīng)在采樣后立即用 5％硫代硫酸鈉溶液充分中和余氯。 接種污水的集菌液：全部接種于改良羅氏培養(yǎng)基或小川氏培養(yǎng)基培養(yǎng)管內(nèi)斜面上，每支培養(yǎng)管接種 。污泥的集菌液：吸取兩個(gè) ，分別接種于改良羅氏培養(yǎng)基或小川氏培養(yǎng)基培養(yǎng)管 圖 E 結(jié) 核 桿 菌 檢 驗(yàn) 程 序 初 步 鑒 定 ： 對(duì) 可 疑 菌 落 作 抗 酸 染 色 ， 染 色 陽 性 者 再 作 分 離 傳 代 鑒 定 ： 致 病 力 試 驗(yàn) 檢 驗(yàn) 結(jié) 果 報(bào) 告 培 養(yǎng) ： 接 種 于 羅 氏 培 養(yǎng) 基 或 小 川 氏 培 養(yǎng) 基 37℃ 、 培 養(yǎng) 8周 28℃ 、 培 養(yǎng) 2～ 4周 污 水 集 菌 ： 過 濾 離 心 法 或 直 接 離 心 法 污 泥 集 菌 ： 過 濾 離 心 法 25 / 28內(nèi)斜面上。 培養(yǎng)已接種的培養(yǎng)基置于 37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng) 2 周后開始觀察結(jié)果，每周觀察 2 次。一般需要培養(yǎng) 8 周。 分離菌株：在羅氏培養(yǎng)基上呈淡黃色或無色的粗糙型菌落，作抗酸染色，陽性者作分離傳代。分離傳代菌株如生長速度在兩周以上，則需作菌型鑒定；應(yīng)用耐熱觸酶試驗(yàn)和傳代培養(yǎng)于 28℃培養(yǎng) 2～4 周，觀察是否生長，用此方法即可進(jìn)行初步鑒定。 致病力試驗(yàn) 耐熱觸酶反應(yīng)陰性，28℃不生長之菌落為可疑結(jié)核桿菌。于小白鼠尾靜脈接種 lmg 菌量(5mg／mL 菌液，每只動(dòng)物接種 )，死亡時(shí)觀察病變或 8 周后解剖臟器發(fā)現(xiàn)典型結(jié)核病變者可確認(rèn)為檢出結(jié)核桿菌。其耐熱觸酶試驗(yàn)方法如下： 取菌落 3～5 mg 分散于 磷酸鹽緩沖液中，置 68℃水浴中 20min 后取出．冷卻后加吐溫 80h 和過氧化氫溶液混合液 。 發(fā)生氣泡為陽性，30min 不產(chǎn)生氣泡者為陰性。人型、牛型結(jié)核桿菌，胃分枝桿菌和海魚分枝桿菌為陰性，其他非典型抗酸菌和非致病抗酸菌為陽性。人型、牛型結(jié)核桿菌在28℃培養(yǎng)不生長，胃分枝桿菌和海魚分枝桿菌 28℃培養(yǎng)能生長。E5 檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告根據(jù)檢驗(yàn)結(jié)果，報(bào)告一定體積的樣品中存在或不存在結(jié)核桿菌。附錄 F(規(guī)范性附錄)醫(yī)療機(jī)構(gòu)污水污染物（COD、BOD、SS）單位排放負(fù)荷計(jì)算方法F1 水污染物單位排放負(fù)荷計(jì)算公式：L= CQ/N式中：L水污染物排放單位負(fù)荷（g/ ）C污染物排放濃度（mg/L）Q日排水量（m 3/ d）N床位數(shù)（床