db21t17493-20xx黃瓜綠斑駁花葉病毒檢驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)規(guī)程doc-資料下載頁(yè)
2025-07-15 11:29本頁(yè)面
【正文】 er R）：5′CTAAGCTTTCGAGGTGGTAGC3′。 RTPCR實(shí)驗(yàn)步驟 cDNA合成 按下列組分制備RT反應(yīng)體系10mL，反應(yīng)以加入不含RNase 的dH2O為陰性對(duì)照，反應(yīng)條件為42℃ 1 h；99℃ 5 min；5℃ 5 min擴(kuò)增cDNA。 PCR擴(kuò)增在冰浴上依次將下列組分加入PCR反應(yīng)管中，反應(yīng)采用50 μL體系。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，53℃退火45s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸 10 min。 RTPCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳檢測(cè) 取5 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物用6loading buffer溶解，點(diǎn)樣。電泳檢測(cè)，用溴化乙錠（EB）溶液進(jìn)行染色30 min。在Image Master紫外成相系統(tǒng)（Pharmacia Biotech）上觀察結(jié)果并攝像。表 RT反應(yīng)體系反應(yīng)組成體積（μL）Primer R（10μM）MgCl2210RT Buffer1RNase free dH2OdNTP Mixture（各10mM）1RNase Inhibitor （40 U/μL）AMV Reverse TranscriptaseRNA1Total10表 PCR反應(yīng)體系反應(yīng)組成體積（μL）5PCR buffer10ddH2OTaKaRa ETaqHSPrimer F（10μM）RT產(chǎn)物（cDNA）10Total50 結(jié)果評(píng)定觀察電泳結(jié)果，PCR產(chǎn)物在500bp處有條帶出現(xiàn)，判斷樣品攜帶黃瓜綠斑駁花葉病毒，否則為陰性。 樣品保存對(duì)于檢測(cè)結(jié)果顯示為陽(yáng)性的樣品，必須對(duì)樣品進(jìn)行保存?zhèn)洳?。種子樣品應(yīng)保存在4℃冰箱內(nèi)，葉片和果實(shí)樣品應(yīng)保存在20℃冰箱內(nèi)。 結(jié)果記錄與資料保存完整的實(shí)驗(yàn)記錄包括：樣品的來(lái)源、種類、接收時(shí)間，實(shí)驗(yàn)的時(shí)間、地點(diǎn)、方法和結(jié)果等，并要有經(jīng)手人和實(shí)驗(yàn)人員的簽字。PCR檢測(cè)需有電泳結(jié)果照片及測(cè)序結(jié)果。附錄E(規(guī)范性附錄)黃瓜綠斑駁花葉病毒快速診斷試紙條或檢測(cè)盒測(cè)定標(biāo)準(zhǔn) 植物樣品在檢測(cè)前需經(jīng)研磨，并用緩沖液稀釋。植物葉片樣品可使用配套制樣管或制樣袋進(jìn)行樣品處理。 將樣品葉片（半片至一片）放入制樣管中，充分進(jìn)行震蕩混勻，使樣品達(dá)到研磨效果，靜置待檢。 制樣袋樣品處理：將樣品葉片（半片至一片）放入制樣袋中，用研磨棒在制樣袋外側(cè)充分研磨。使用前將試紙條或檢測(cè)盒恢復(fù)至室溫（15℃～30℃）。從包裝中取出試紙條，有“箭頭”標(biāo)記端為樣品端。樣品端垂直向下，插入準(zhǔn)備好的樣品液中。樣品液不要超過膠體金試紙條上的MAX線。在檢測(cè)過程中，檢測(cè)條應(yīng)一直浸在樣品液中，直到檢測(cè)液爬至檢測(cè)膜的中部，取出放平，閱讀檢測(cè)結(jié)果。從包裝中取出診斷盒，將檢測(cè)盒放平，吸取待測(cè)樣品1～2滴滴入加樣窗口中，觀察檢測(cè)結(jié)果。測(cè)試觀察的時(shí)間以10 min～20 min為好。對(duì)于病毒濃度低的樣品時(shí)間可適當(dāng)延長(zhǎng)?！?陽(yáng)性結(jié)果：質(zhì)控線顯粉紅色，測(cè)試線也顯粉紅色，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性?！?陰性結(jié)果：質(zhì)控線顯粉紅色，測(cè)試線未顯色，檢測(cè)結(jié)果為陰性?！?無(wú)效結(jié)果：質(zhì)控線和測(cè)試點(diǎn)線均未顯色，說明試紙條失效，檢測(cè)結(jié)果無(wú)效。 試紙條和快速診斷盒應(yīng)在有效期內(nèi)使用。 試紙條和快速診斷盒應(yīng)在2℃～8℃冰箱內(nèi)密封干燥保存。使用時(shí)注意未用的要密封。以免吸濕而失效。使用溫度應(yīng)在15℃～30℃。 樣品制備對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響明顯。如樣品液中有大量組織塊，會(huì)影響檢測(cè)條吸取樣品液；如樣品液太稀，則易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。 檢測(cè)試紙條浸入樣品液的深度：浸入深度不能超過“MAX”標(biāo)記。如浸入太深，試紙條的一些有效成分會(huì)被稀釋進(jìn)入樣品液中，而不是進(jìn)入檢測(cè)區(qū)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)反應(yīng)，出現(xiàn)無(wú)效結(jié)果。如浸入太淺，則樣品液擴(kuò)散速度降低，甚至無(wú)法向上擴(kuò)散，同樣出現(xiàn)無(wú)效結(jié)果。 檢測(cè)試紙條不能回收或重復(fù)使用?！?1
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