高二生物基因工程和細(xì)胞工程-資料下載頁(yè)
2024-11-09 03:47本頁(yè)面
【導(dǎo)讀】又稱(chēng)DNA文庫(kù)，是指某個(gè)生物的基因組DNA. 基因文庫(kù)由外源DNA片段、載體和宿主細(xì)胞。將某種生物體的全部基因組DNA用限制性?xún)?nèi)。應(yīng)的宿主細(xì)胞獲得的所有陽(yáng)性菌落。1)提取研究對(duì)象基因組DNA，制備合適大小的DNA片段，或提取組織或器官的mRNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA；3)重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞或體外包裝后侵染受體菌；4)陽(yáng)性重組菌落或噬菌斑的篩選。因此，要想從龐大的基因組中分離某個(gè)特定。探針是一小段帶標(biāo)記的單鏈DNA或者RNA. 最初是使用帶放射性的DNA探針，通過(guò)放射自顯。設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物，直接從基因組DNA中擴(kuò)增該。依照其他物種中該基因的保守區(qū)段序列設(shè)計(jì)引物，cDNA文庫(kù)中釣出該基因。PCR法獲取目的基因的前提是：要有足夠制備。降解的DNA材料都可以作為起始材料；目的基因的獲得通常采用PCR法；化。子檢測(cè)混合樣品中未知核酸分子或蛋白質(zhì)分子。根據(jù)其檢測(cè)對(duì)象的不同可分為Southern雜交。將DNA片段轉(zhuǎn)移到固體支持物(硝酸纖維素濾膜或尼。通過(guò)顯影檢查目的DNA所在的位置。中文一般稱(chēng)為蛋白質(zhì)印跡技術(shù)。
【正文】 嘌呤基形成嘌呤單磷酸核苷酸，而 TK可催化胸苷轉(zhuǎn)化為 5’單磷酸胸苷，作為胸苷脫氧核苷酸合成的材料。 HAT選擇培養(yǎng)基 ? 含次黃嘌呤（ H）、氨基蝶呤（ A）和胸腺嘧啶核苷（ T）的培養(yǎng)基，是動(dòng)物雜交細(xì)胞篩選中最常用的方法。在這種培養(yǎng)基中細(xì)胞只能利用旁路途徑合成 DNA，因而只有具有 HGPRT+或 /和 TK+的細(xì)胞才能生長(zhǎng) 。 在 HAT選擇培養(yǎng)基中 骨髓瘤瘤細(xì)胞（ HGPRT或 TK）及其同核體： 不能增殖， → 死亡； B淋巴細(xì)胞及其同核體： 體外培養(yǎng)條件下增殖次數(shù)有限， → 死亡； 雜交瘤細(xì)胞： → 存活 陽(yáng)性細(xì)胞的篩選 ? 將融合細(xì)胞充分稀釋?zhuān)M(jìn)行克隆培養(yǎng)；然后再通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 ( ELISA) ，篩選出能夠分泌較高水平抗體的融合細(xì)胞，即陽(yáng)性細(xì)胞，再進(jìn)行克隆化培養(yǎng)。 雜交瘤細(xì)胞的克隆培養(yǎng) ? 有限稀釋法 ：將稀釋到一定密度的雜交瘤細(xì)胞接種到 96孔培養(yǎng)板中，盡可能使每個(gè)孔中只有一個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)； ? 軟瓊脂培養(yǎng)法 ：軟瓊脂的半固態(tài)性質(zhì)，使單個(gè)的雜交瘤細(xì)胞在相對(duì)固定的位置上增殖形成細(xì)胞克隆。 ? 一般情況下，雜交瘤細(xì)胞的染色體處于不穩(wěn)定狀態(tài)，因此當(dāng)細(xì)胞分裂時(shí)，染色體分配不平衡，易造成雜交瘤細(xì)胞在分裂增殖過(guò)程中失去抗體分泌能力，所以克隆化培養(yǎng) 3～ 5次后，才能獲得穩(wěn)定基因型和穩(wěn)定分泌特異性抗體的細(xì)胞。 單克隆抗體的大量制備 ? 體內(nèi)法：將穩(wěn)定的單克隆細(xì)胞注入到小鼠腹腔培養(yǎng)，然后從腹水中分離、提取單克隆抗體。 ? 細(xì)胞培養(yǎng)：體外克隆培養(yǎng)，再?gòu)呐囵B(yǎng)液中回收產(chǎn)生的抗體。 單克隆抗體的純化 ? 通過(guò)上述培養(yǎng)之后獲得的培養(yǎng)液或腹水，其中除了單克隆抗體之外，還有無(wú)關(guān)的蛋白質(zhì)等其他物質(zhì)，因此必須對(duì)產(chǎn)品做分離純化。目前，常用的方法有硫酸銨沉淀法、鹽析法、離子交換、凝膠過(guò)濾或親和層析等等。一般是綜合采用幾種方法分步進(jìn)行純化。 單克隆抗體的應(yīng)用 ? 1. 作為親合層析的配體 ? 單克隆抗體能與其相應(yīng)的抗原特異性結(jié)合，因而能夠從復(fù)雜系統(tǒng)中識(shí)別出單個(gè)成分。只要得到針對(duì)某一成分的單克隆抗體，利用它作為配體，固定在層析柱上，通過(guò)親合層析，即可從復(fù)雜的混和物中分離、純化這一特定成分。如用抗人絨毛膜促性腺激素 (hCG)親合層析柱，就可從孕婦尿中提取到純的 hCG。與其它提取方法 (沉淀法、高效疏水色譜法等 )相比，具有簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)、產(chǎn)品活性高等優(yōu)點(diǎn)。 2. 作為生物治療的導(dǎo)向武器 ? 將針對(duì)某一腫瘤抗原的單克隆抗體與化療藥物或放療物質(zhì)連接，利用單克隆抗體的導(dǎo)向作用，將化療藥物或放療物質(zhì)攜帶至靶器官，可直接殺傷靶細(xì)胞。 ? 另外，將放射性標(biāo)記物與單克隆抗體連接，注入患者體內(nèi)可進(jìn)行放射免疫顯像，協(xié)助腫瘤的診斷。 治療用脂質(zhì)體 ? 單克隆抗體以其特異性強(qiáng)、純度高、均一性好等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、放射免疫分析、免疫組化和流式細(xì)胞儀等技術(shù)，目前，應(yīng)用單克隆抗體制作的商品化試劑盒廣泛應(yīng)用于：①病原微生物抗原、抗體的檢測(cè)；②腫瘤抗原的檢測(cè)；③免疫細(xì)胞及其亞群的檢測(cè)；④激素測(cè)定；⑤細(xì)胞因子的測(cè)定。 4. 作為研究抗原的探針 ? 例如前面講的 Western blotting。 5. 作為免疫抑制劑 ? 抗人 T淋巴細(xì)胞單抗 (McAb)作為一種新型免疫抑制劑，已廣泛應(yīng)用于臨床治療自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反應(yīng)。注射抗小鼠 Thy1抗原的單抗，可以抑制小鼠同種皮膚移植的排斥反應(yīng)。此外，對(duì)用于同種骨髓移植的供體骨髓，在體外經(jīng)抗 T細(xì)胞單抗加補(bǔ)體處理，能減輕移植物抗宿主病的發(fā)生。
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