國家標(biāo)準(zhǔn)-新城疫診斷技術(shù)【整理版】-資料下載頁
2025-07-14 19:33本頁面
【正文】 a)第一階段，反轉(zhuǎn)錄42℃／45 rain； b)第二階段，預(yù)變性95℃／3 rain；c)第三階段，94℃／30 s，55℃／30 s，72℃／45 S，30個(gè)循環(huán)；d)第四階段，72℃／7 rain。最后的RTPCR產(chǎn)物置4℃保存。7．3．5電泳 操作程序如下： a)制備1．5％瓊脂糖凝膠板；b)取5 pL PCR產(chǎn)物與0．5 pL加樣緩沖液混合，加入瓊脂糖凝膠板的加樣孔中；c)加入DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物；d)蓋好電泳儀，插好電極，5 V／cm電壓電泳，30 min～40 rain e)紫外線燈下觀察結(jié)果，凝膠成像儀掃描圖片存檔，打?。?f)用分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物比較判斷PCR片段大小。7．4結(jié)果判定結(jié)果判定細(xì)則如下：a)出現(xiàn)0．5 kb大小左右的目的片段(與陽性對(duì)照大小相符，參見附錄c)，而陰性對(duì)照無目的片 段出現(xiàn)方可判為新城疫病毒陽性。b)對(duì)于擴(kuò)增到的目的片段，需進(jìn)一步進(jìn)行序列測(cè)定，從分子水平確定其致病性強(qiáng)弱。c)根據(jù)序列測(cè)定結(jié)果，對(duì)毒株F基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行分析，如果毒株F2蛋白的c端有 “多個(gè)堿性氨基酸殘基”，F(xiàn)l蛋白的N端即117位為苯丙氨酸，可確定為新城疫強(qiáng)毒感染。“多 個(gè)堿性氨基酸”指在113位到116位殘基之間至少有三個(gè)精氨酸或賴氨酸。6GB／T 1655020088綜合判定8．1 臨床診斷符合第3章規(guī)定的臨床癥狀和病理變化，按第4章進(jìn)行病毒分離與鑒定結(jié)果為新城疫病 毒陽性且ICPI≥o．7，診斷為新城疫。8．2臨床診斷符合第3章規(guī)定的臨床癥狀和病理變化，按第7章進(jìn)行RTPCR檢測(cè)結(jié)果呈陽性且經(jīng) 序列分析證明F蛋白裂解位點(diǎn)具有強(qiáng)毒特征，診斷為新城疫。8．3患禽沒有明顯的臨床癥狀和病理變化，但病原檢測(cè)符合8．1或8．2，可判定為新城疫病毒強(qiáng)毒 感染。7GB／T 165502008附錄A (資料性附錄) pH7。2磷酸鹽緩沖液(PBS)配制pH7．2磷酸鹽緩沖液(PBS)配制： 氯化鈉(NaCl)8．0 g 氯化鉀(KCl)0．2 g 磷酸氫二納(NazHPO。) 1．44 g 磷酸二氫納(KHzPO。)0．24 g 加蒸餾水至 1 000mL將上述成分依次溶解，用鹽酸(Hcl)調(diào)pH至7．2，分裝，121℃、15 rain高壓滅菌。GB／T 1 65502008附錄B(資料性附錄)1％雞紅細(xì)胞懸液(RBc)制備采集至少三只SPF公雞或無禽流感和新城疫抗體的非免疫雞的抗凝血液，放入離心管中，加入 三倍～四倍體積的PBS混勻，以2 000 r／min離心5 rain 10 rain，去掉血漿和白細(xì)胞層，重復(fù)以上過 程，反復(fù)洗滌三次(洗凈血漿和白細(xì)胞)，最后吸取壓積紅細(xì)胞用PBS配成體積分?jǐn)?shù)為1％的懸液，于4℃保存?zhèn)溆谩?附錄c(瓷料性附錄) 新城疫病毒RTPCR檢測(cè)陽性參照圍C 1新城疫病毒RToPCR檢禹陽性參照?qǐng)D啪啪瑚舌} 瑚 啪圖C 1C 2說明C 2 1瓊脂糖凝腔的濃度為1 5％。C 2 2 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物(Marker)為DLZ000
法律信息相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1