【導(dǎo)讀】1975-1977年DNA測(cè)序時(shí)代來臨：Sanger提出酶法測(cè)序，Maxam和Gilbert提出化學(xué)降解。盡管這么多年一直是Sanger測(cè)序的天下，但是在剛剛問世時(shí)，Maxam-Gilbert測(cè)序。及其同事完成的。phiX174噬菌體的基因組為單鏈環(huán)狀，共有5836個(gè)堿基。1980年“鳥槍法測(cè)序”誕生，這是Sanger的又一大革命性發(fā)現(xiàn)。他和同事使用這種技術(shù)。從那時(shí)起，一些病毒基因組就陸續(xù)完成，包括229kb的巨細(xì)胞病。毒基因組，186kb的天花基因組。此計(jì)劃由美國科學(xué)家于1985年率先提出，于1990. 美國、英國、法國、德國、日本和我國科學(xué)家共同參與了這一預(yù)算達(dá)30億。按照這個(gè)計(jì)劃的設(shè)想，在2020年要揭開組成人體4萬個(gè)基因的30. 億個(gè)堿基對(duì)的秘密。人類基因組計(jì)劃與曼哈頓原子彈計(jì)劃和阿波羅計(jì)劃并稱為三大科學(xué)計(jì)。基因組大約有Mb和6275個(gè)基因，其中約5800個(gè)基因被認(rèn)為是有功能的基因。該公司2020年被GE收購。整個(gè)基因組進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序數(shù)據(jù)總量達(dá)到1177億堿基對(duì)，基因組平均測(cè)序深度達(dá)到36倍，有效覆蓋率高達(dá)％，變異檢測(cè)精度達(dá)％以上。2020年第三代測(cè)序風(fēng)起云涌。

　　

【正文】 能得到的最大數(shù)據(jù)量為 300GB（使用最新設(shè)計(jì)的 nanobeads）。測(cè)序的系統(tǒng)準(zhǔn)確性能達(dá)到 %。 Life Technologies（ 2020 年 Invitrogen 和 Applied BiosystemsABI 宣布正式合 并為 Life Technologies Corporation。 合并后， Life Technologies 將繼續(xù)保留 Invitrogen 和 Applied Biosystems(以下簡(jiǎn)稱 ABI)作為新公司的獨(dú)立品牌。新公司儀器和系統(tǒng)解決方案，如 SOLiD?, RTPCR and 質(zhì)譜都將繼續(xù)以 ABI 品牌銷售 ,而原 ABI 旗下的試劑品牌，如 Ambion 等產(chǎn)品，包括眾多的試劑都將歸于 Invitrogen 品牌。新公司不僅為客戶提供最好的儀器，而且還有最優(yōu)化的系統(tǒng)解決方案，以及試劑銷售渠道。 ） 在第三代測(cè)序上也不甘落 后 ， 即將推出單分子測(cè)序平臺(tái)。此平臺(tái)將使用 Qdot 納米晶體作為核心的測(cè)序引擎 ， 監(jiān)測(cè)核苷酸實(shí)時(shí)摻入到增長的 DNA 鏈中。它最大的與眾不同之處在于有望通過試劑更換實(shí)現(xiàn)沒有限制的讀長 ， 這一點(diǎn)聽上去相當(dāng)有吸引力 ， 連 Craig Venter 都被吸引了。 JCVI 等研究所目前正在試用。該平臺(tái)有望在 2020 年 上市。 有時(shí)名不見經(jīng)傳的小公司也能讓人刮目相看。在 2020 年 的 美國基因組生物學(xué)技術(shù)進(jìn)展年會(huì)（ AGBT） ， Ion Torrent 推出了一款廉價(jià)小巧的新一代測(cè)序儀，成為本次年會(huì)最大的驚喜。該平臺(tái)被戲稱為 “測(cè)序的 pH 計(jì) ”。它在半 導(dǎo)體芯片的微孔中固定 DNA 鏈，隨后依次摻入ACGT。隨著每個(gè)堿基的摻入，釋放出氫離子，并改變?nèi)芤旱?pH 值，從而被離子傳感器所檢測(cè)。該平臺(tái)價(jià)廉物美，前途無量， Life Technologies 也看到了這一點(diǎn)，于是在年中的時(shí)候以 億美元收購了 Ion Torrent， 并于不久前推出了 Ion Personal Genome Machine（ PGM?）測(cè)序儀 。 2020 年的另一個(gè)驚喜來自于 Pacific Biosciences 的 SMRT（單分子、實(shí)時(shí)）系統(tǒng) 。該系統(tǒng)能讓研究人員在短短的幾分鐘內(nèi)對(duì)長片段 DNA 進(jìn)行測(cè) 序。從樣本制備到測(cè)序，所需的時(shí)間還不到一天。典型的測(cè)序運(yùn)行時(shí)間低至 30 分鐘。序列數(shù)據(jù)在幾分鐘之內(nèi)就能產(chǎn)生，而不是幾天，這對(duì)于傳染病監(jiān)控和分子病理學(xué)尤為重要。目前的讀長超過 1kb，比第二代測(cè)序要長得多。 PacBio RS 測(cè)序儀已于 2020 年 11 月上市 ，聽說購買的人太多了，工廠根本來不及生產(chǎn)。 相比之下，最早推出新一代測(cè)序儀的 羅氏 /454 公司 似乎沉寂了不少，今年只有 GS Junior推出。 不過 454 正在與 IBM 合作，欲共同開發(fā)基于納米孔的測(cè)序技術(shù) 。根據(jù)羅氏和 IBM 的說法，與其它現(xiàn)有測(cè)序技術(shù)或正在開發(fā)的技術(shù)相比， 這項(xiàng)技術(shù)在費(fèi)用、通量、規(guī)模和速度上都具有 “重大優(yōu)勢(shì) ”。讓我們拭目以待吧。 四、第二代測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域 簡(jiǎn)述 從頭測(cè)序 （ denovo sequencing） 對(duì)于基因組未被測(cè)序過的生物，其基因組測(cè)序需要從頭測(cè)序。受測(cè)序讀取長度的限制，新一代測(cè)序技術(shù)中只有 454 能夠獨(dú)立完成復(fù)雜基因組如真核生物基因組的從頭測(cè)序， Solexa和 SOLiD 只能完成簡(jiǎn)單生物如細(xì)菌的基因組的從頭測(cè)序。 在復(fù)雜基因組的從頭測(cè)序中，將Solexa、 SOLiD 與 454 測(cè)序技術(shù)或傳統(tǒng)的 Sanger 測(cè)序技術(shù)相結(jié)合，分別利用它們的高通量和較長 讀長優(yōu)勢(shì)，可大大降低檢測(cè)成本，提高測(cè)序速度。 如 黃瓜的全基因組測(cè)序 ，就聯(lián)合運(yùn)用了 Solexa 技術(shù)和 Sanger 技術(shù)，得到平均 倍覆蓋度的黃瓜基因組序列，其中 倍是用 Sanger 技術(shù)得到了， 倍是運(yùn)用 Solexa 的 GA 測(cè)序平臺(tái)得到的。 重測(cè)序 如果對(duì)照一個(gè)參考基因組，新一代測(cè)序技術(shù)可以在短時(shí)間內(nèi)非常輕松地完成一個(gè)基因組的重測(cè)序。 通過重測(cè)序，可以看到單核苷酸多態(tài)性，突變熱點(diǎn)，基因組結(jié)構(gòu)變異，群體多態(tài)性等信息。 2020 年，由中國、美國和英國共同啟動(dòng)的 千人基因組計(jì)劃 （ 1000 Genomes Project）是人類基因組計(jì)劃的延續(xù)，也是迄今最大的基因組重測(cè)序計(jì)劃。 45 Illumina 和 ABI 共同加入了該計(jì)劃。 SNP 全稱是 Single Nucleotide Polymorphism，意即單核苷酸多態(tài)性， 是指不同個(gè)體的基因組上單個(gè)核苷酸的變異，包括替換、缺失和插入。 SNP 在基因組中分布相當(dāng)廣泛，一般來說， SNP 是指變異頻率大于 1%的單核苷酸變異。 SNP 可作為標(biāo)記，許多表型變異、對(duì)藥物或疾病的易感性等等都可能與 SNP 有關(guān)。研究 SNP 是人類基因組計(jì)劃走向應(yīng)用的重要一環(huán)，因?yàn)樗峁┝艘粋€(gè)強(qiáng)有力的工具，用 于高危群體的發(fā)現(xiàn)、疾病相關(guān)基因的鑒定、藥物的設(shè)計(jì)和測(cè)試以及生物學(xué)的基礎(chǔ)研究等。 新一代測(cè)序技術(shù)利用其高通量、低成本的優(yōu)勢(shì)，對(duì)較多的個(gè)體測(cè)序，很容易得到大量的 SNP 位點(diǎn)。 Feuk 等發(fā)現(xiàn)，人類基因組中存在的結(jié)構(gòu)變異遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了人們的預(yù)計(jì)，而其中有很多變異都會(huì)造成重大的結(jié)構(gòu)改變。 Trick 等通過 Solexa 測(cè)序，鑒定了甘藍(lán)型油菜栽培種 2 萬 4 萬多個(gè) SNP。 在進(jìn)化領(lǐng)域，科學(xué)家通過群體多態(tài)性分析探索物種之間的進(jìn)化模式；在微生物領(lǐng)域， DNA 測(cè)序分型已被證明快捷而準(zhǔn)確；而在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域， 基因組重測(cè)序在發(fā)現(xiàn) SNP 與重大疾病關(guān)系方面 有著重要的意義。 宏基因組學(xué)研究 宏基因組測(cè)序是指從環(huán)境中直接提取所有物種的 DNA 進(jìn)行全基因組測(cè)序，與傳統(tǒng)的微生物研究相比，宏基因組研究跳出了實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的局限，真實(shí)地描述大自然生態(tài)群落的復(fù)雜性和多樣性，對(duì)于人類更好地了解微生物群落有著重要的意義。 歐盟推出的人類腸道宏基因組計(jì)劃（ MetaHIT），就是通過研究人類腸道中所有微生物的種類，為腸道微生物與肥胖等人類疾病的關(guān)系提供重要的理論依據(jù)。 轉(zhuǎn)錄組和表達(dá)譜分析 基因表達(dá)譜（ gene expression profile）是指細(xì)胞在特定的條件下表達(dá)的所有 基因。 分析表達(dá)譜是了解組織或器官行使功能的分子基礎(chǔ)及環(huán)境和病變影響生物的分子機(jī)制等的重要手段。以往的基因表達(dá)譜分析主要是依靠基因芯片技術(shù)，該技術(shù)需要依賴已知的基因序列來設(shè)計(jì)探針，通過熒光標(biāo)記和雜交，根據(jù)熒光的強(qiáng)度計(jì)算表達(dá)量的多少，誤差較大，而且無法檢測(cè)未知基因的表達(dá)量。 第二代高通量測(cè)序技術(shù)可對(duì)單個(gè)細(xì)胞樣品中的所有 RNA 即整個(gè)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行整體測(cè)序，對(duì)每個(gè)細(xì)胞中表達(dá) 150000 個(gè)拷貝 mRNA 的基因都能夠檢測(cè)，該技術(shù)還可以檢測(cè)以前沒有發(fā)現(xiàn)過的基因或 新的轉(zhuǎn)錄本 （ transcript），定量測(cè)定基因的表達(dá)模式。 如 Mortazavi 等利用Solexa 技術(shù)對(duì)小鼠的大腦、肝臟和骨骼肌進(jìn)行了 RNA 測(cè)序，對(duì)測(cè)得的每條序列進(jìn)行計(jì)數(shù)從而獲得每個(gè)特定轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量，能檢測(cè)到 豐度非常低的轉(zhuǎn)錄本 。分析測(cè)得的序列，至少有3500 個(gè)基因擁有不止一種 剪切形式 ，其中有近 10%是從未報(bào)道過的 RNA 剪切形式。同年，Sugarbaker 利用 mRNA 深度測(cè)序?qū)盒孕啬ち龊蛯?duì)照樣品進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)了腫瘤細(xì)胞基因組中存在的 15 個(gè)不同的 點(diǎn)突變 。 這邊需要特別指出的是第二代測(cè)序結(jié)合微陣列技術(shù)而衍生出來的應(yīng)用 目標(biāo)序列捕獲測(cè)序技術(shù) （ Targeted Resequencing） 。這項(xiàng)技術(shù)首先利用微陣列技術(shù)合成大量寡核苷酸探針，這些寡核苷酸探針能夠與基因組上的特定區(qū)域互補(bǔ)結(jié)合，從而富集到特定區(qū)段，然后用第二代測(cè)序技術(shù)對(duì)這些區(qū)段進(jìn)行測(cè)序。 目前提供序列捕獲的廠家有 Agilent 和 Nimblegen ，應(yīng)用最多的是人全外顯子組捕獲測(cè)序。 科學(xué)家們目前認(rèn)為外顯子組測(cè)序比全基因組重測(cè)序更有優(yōu)勢(shì)，不僅僅是費(fèi)用較低，更是因?yàn)橥怙@子組測(cè)序的數(shù)據(jù)分析計(jì)算量較小，與生物學(xué)表型結(jié)合更為直接。 小分子 RNA（ miRNA） 研究 第二代測(cè)序技術(shù)還被廣泛應(yīng)用于小分子 RNA（ microRNA， miRNA）或 非編碼 RNA（ ncRNA） 表達(dá)研究。 非編碼的小分子 RNA 參與了許多重要的發(fā)育過程。 它們只有 1840個(gè)核苷酸，正好在新一代高通量測(cè)序的讀長范圍內(nèi)。第二代測(cè)序 還能發(fā)現(xiàn)新的小分子 RNA。如利用 Illumina 的測(cè)序技術(shù)對(duì)人胚胎干細(xì)胞發(fā)育前后的分析，獲得了 334 個(gè)已知的和 104 個(gè)新發(fā)現(xiàn)的小 RNA 的表達(dá)譜。 通過測(cè)序，科學(xué)工作者可以預(yù)測(cè)新的 miRNA，研究 miRNA 的保守性，建立 miRNA 的表達(dá)譜，比較 miRNA 表達(dá)豐度以及發(fā)現(xiàn)其他非編碼 RNA 等 。 轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究（ ChIPseq） 染色體免疫共沉淀 （ chromatin immunoprecipitation， ChIP） 技術(shù)是研究蛋白 DNA 相互作用的重要方法。 以往的研究需要結(jié)合芯片技術(shù) （ ChIPonchip 或 ChIPchip），因?yàn)樾酒夹g(shù)基于雜交原理，需根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)探針，對(duì)于未知的序列無能為力。把 ChIP 技術(shù)和第二代測(cè)序技術(shù)相結(jié)合，即 ChIPsequencing（ ChIPseq），可以在基因組水平上很方便地檢測(cè)某種蛋白所結(jié)合的 DNA 序列，全面了解蛋白質(zhì) DNA 的相互作用。如 2020 年 Ouyang 等利用 ChIPseq 技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在小鼠的胚胎 干細(xì)胞中，大約有 65%的基因表達(dá)是由 12 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的。 DNA 甲基化測(cè)序 DNA 甲基化是另一種重要的基因調(diào)控方式，它通過改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)， DNA 穩(wěn)定性及DNA 與蛋白質(zhì)相互作用方式，從而控制基因表達(dá)。 Taylor 等利用 454 技術(shù)，發(fā)現(xiàn)不同的疾病表現(xiàn)出不同的甲基化模式； Barski 等應(yīng)用 Solexa 技術(shù)繪制了人類基因組 20 多個(gè)組蛋白甲基化位點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)單甲基化通常與基因激活相關(guān)聯(lián)，而三甲基化則與基因沉默有緊密聯(lián)系。