【正文】 性高，但是經過SDSPAGE變性膠電泳的蛋白質可能由于原來的識別位點構象發(fā)生改變而不被識別，多抗不如單抗專一性高但更容易得到結果。 附：在Western Blotting實驗過程中使用內參的方法有： 一、 超級簡便的標記內參使用法：只要在二抗孵育時加入HRP標記內參抗體，按照正常操作即可。 二、普通內參：當目的蛋白的分子量大小與選用的內參蛋白分子量相差不大時，可以先進行目的蛋白的抗體溫育顯色和檢測。然后使用Strip緩沖液洗掉膜上的抗體，重新進行內參蛋白的抗體溫育、顯色檢測。 三、當目的蛋白的分子量大小與選用的內參蛋白分子量大小相差比較明顯情況下，可以在轉膜后預染，根據蛋白質Marker的大小將膜剪為大分子量和小分子量兩部分，使內參蛋白與目的蛋白分開。然后兩塊膜分別與內參蛋白抗體以及目的蛋白抗體進行溫育，二抗溫育以及顯色。 本文引用地址： 該貼已經同步到 賴瑋婧的微博 已有 1 人評分威望收起 理由 root + 10 贊一個! 總評分: 威望 + 10 查看全部評分 丙稀, 丙烯酰胺, 緩沖液, 離子水 分享到：新浪微博騰訊微博空間騰訊朋友百度貼吧人人網開心網復制網址1 .空間騰訊微博騰訊朋友.轉播轉播0 分享淘帖0 分享分享0 收藏收藏1 頂頂0 踩踩0 轉發(fā)到微博 .書到用時方恨少 回復 舉報 . 賴瑋婧 .查看詳細資料321主題 4聽眾 4813積分 論壇元老Rank: 8Rank: 8 收聽TA 發(fā)消息. 2 發(fā)表于 201264 21:27:43 |只看該作者 Western實驗步驟 Western，也稱Western blot、Western blotting、Western印跡，是用抗體檢測蛋白的重要方法之一。Western可以參考如下步驟進行操作。 1. 收集蛋白樣品(Protein sample preparation) 可以使用適當的裂解液，例如碧云天生產的Western及IP細胞裂解液(P0013)、RIPA裂解液等，裂解貼壁細胞、懸浮細胞或組織樣品。對于某些特定的亞細胞組份蛋白，例如細胞核蛋白、細胞漿蛋白、線粒體蛋白等，可以參考相關文獻提取這些亞細胞組份蛋白，也可以使用試劑盒進行抽提，例如碧云天生產的細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒(P0028)。 收集完蛋白樣品后，為確保每個蛋白樣品的上樣量一致，需要測定每個蛋白樣品的蛋白濃度。根據所使用的裂解液的不同，需要采用適當的蛋白濃度測定方法。因為不同的蛋白濃度測定方法對于一些去垢劑和還原劑等的兼容性差別很大。如果使用碧云天生產的Western及IP細胞裂解液或RIPA裂解液，可以使用BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)。 2. 電泳(Electrophoresis) (1) SDSPAGE凝膠配制 SDSPAGE凝膠可以參考一些文獻資料進行配制，也可以使用碧云天生產的SDSPAGE凝膠配制試劑盒(P0012A)。該試劑盒提供了除水和配膠器具外的所有試劑以及配制各種濃度SDSPAGE的配方。 (2) 樣品處理 在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDSPAGE蛋白上樣緩沖液。例如2X或5X的SDSPAGE蛋白上樣緩沖液。使用5X的SDSPAGE蛋白上樣緩沖液可以減小上樣體積，在相同體積的上樣孔內可以上樣更多的蛋白樣品。5X的SDSPAGE蛋白上樣緩沖液可以參考相關文獻資料配制，也可以使用碧云天生產的SDSPAGE蛋白上樣緩沖液(5X)(P0015)。 100℃或沸水浴加熱35分鐘，以充分變性蛋白。 (3) 上樣與電泳 冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到SDSPAGE膠加樣孔內即可。 為了便于觀察電泳效果和轉膜效果，以及判斷蛋白分子量大小，最好使用預染蛋白質分子量標準(P0066)。 電泳時電泳液可以使用碧云天生產的SDSPAGE電泳液(P0014A/P0014B)。 電泳時通常推薦在上層膠時使用低電壓恒壓電泳，而在溴酚藍進入下層膠時使用高電壓恒壓電泳。對于BioRad的標準電泳裝置或類似電泳裝置，低電壓可以設置在80100V，高電壓可以設置在120V左右。SDSPAGE可以采用普通的電泳儀就可以滿足要求，也可以采用碧云天的多功能電泳儀(帶定時)(EEP102)。為了電泳方便起見，也可以采用整個SDSPAGE過程恒壓的方式，通常把電壓設置在100V，然后設定定時時間為90－120分鐘。設置定時可以避免經常發(fā)生的電泳過頭。 通常電泳時溴酚藍到達膠的底端處附近即可停止電泳，或者可以根據預染蛋白質分子量標準的電泳情況，預計目的蛋白已經被適當分離后即可停止電泳。3. 轉膜(Transfer) 我們推薦在Western實驗中選用PVDF膜(FFP30/FFP33)。硝酸纖維素膜(NC膜)(FFN06/FFN09)也可以使用，但硝酸纖維素膜比較脆，在操作過程中特別是用鑷子夾取等過程中容易裂開。膜的使用請參考生產商的推薦使用步驟。 通常如果使用BioRad的標準濕式轉膜裝置，可以設定轉膜電流為300400mA，轉膜時間為3060分鐘。也可以在1520mA轉膜過夜。轉膜時也可以使用碧云天的多功能電泳儀(帶定時)(EEP102)。具體的轉膜時間要根據目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的轉膜時間越長，目的蛋白的分子量越小，需要的轉膜時間越短。 在轉膜過程中，特別是高電流快速轉膜時，通常會有非常嚴重的發(fā)熱現象，最好把轉膜槽放置在冰浴中進行轉膜。 轉膜的效果可以觀察所使用的預染蛋白質分子量標準，通常分子量最大的12條帶較難全部轉到膜上。轉膜的效果也可以用麗春紅染色液(P0022)對膜進行染色，以觀察實際的轉膜效果。也可以用考馬斯亮藍快速染色液(P0017)對完成轉膜的SDSPAGE膠進行染色，以觀察蛋白的殘留情況。 4. 封閉(Blocking) 轉膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預先準備好的Western洗滌液(P0023C)中，漂洗12分鐘，以洗去膜上的轉膜液。從轉膜完畢后所有的步驟，一定要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則極易產生較高的背景。 用微型臺式真空泵(EVAC06/EVAC07)或滴管等吸盡洗滌液，加入Western封閉液(P0023B)，在搖床上緩慢搖動,室溫封閉60分鐘。對于一些背景較高的抗體，可以4℃封閉過夜。在整個Western過程中我們推薦使用碧云天的側擺搖床(ESHK02)或類似儀器，側向擺動速度比較緩慢，而且也容易讓溶液覆蓋蛋白膜。 5. 一抗孵育(Primary antibody incubation) 參考一抗的說明書，按照適當比例用Western一抗稀釋液(P0023A)稀釋一抗。 用微型臺式真空泵或滴管等吸盡封閉液，立即加入稀釋好的一抗，室溫或4℃在側擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。如果一抗孵育一小時效果不佳，可以4℃緩慢搖動孵育過夜?；蚋鼡贵w的說明選擇適當的孵育溫度和時間。 回收一抗。加入Western洗滌液(P0023C)，在側擺搖床上緩慢搖動洗滌510分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液洗滌510分鐘。共洗滌3次。如果結果背景較高可以適當延長洗滌時間并增加洗滌次數。 注：Western結果通常需要提供內參作為對照，通?？梢赃x用Tubulin抗體(AT819)或Actin抗體(AA128)，進行內參檢測。 6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation) 參考二抗的說明書，按照適當比例用Western二抗稀釋液(P0023D)稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗。 二抗需根據一抗進行選擇，例如，一抗是小鼠來源的IgG，則二抗需選擇抗小鼠IgG的二抗，如辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)(A0216)。碧云天有多種二抗提供。 用微型臺式真空泵或滴管等吸盡洗滌液，立即加入稀釋好的二抗，室溫或4℃在側擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。 回收二抗。加入Western洗滌液(P0023C)，在側擺搖床上緩慢搖動洗滌510分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液洗滌510分鐘。共洗滌3次。如果結果背景較高可以適當延長洗滌時間并增加洗滌次數。7. 蛋白檢測(Detection of proteins) 參考相關說明書，使用BeyoECL Plus(P0018)等ECL類試劑來檢測蛋白。壓片可以采用專用的壓片暗盒(FFC58/FFC83)進行。 洗片時可以使用X光片自動洗片機。如果沒有自動洗片機，可以用顯影定影試劑盒(P0019/P0020)自行配制顯影液和定影液進行手工洗片。X光片推薦選用柯達原裝的生物實驗專用柯達XOMAT BT膠片(FF057/FF081)。 8. 膜的重復利用(Membrane recovery) 如果蛋白樣品非常寶貴，可以使用Western一抗二抗去除液(P0025)處理蛋白膜，以重復利用蛋白膜。 回復 舉報 . 李玲 .查看詳細資料92主題 1聽眾 2874積分 金牌會員Rank: 6Rank: 6 收聽TA 發(fā)消息. 3 發(fā)表于 201266 11:38:57 |只看該作者 好厲害啊~一定要去你和廖師兄那學習一下~?。。。?點評賴瑋婧 都還是在摸索中前進啊。 詳情 回復 發(fā)表于 201266 18:19 回復 舉報 . root .查看詳細資料135主題 3聽眾 7798積分 管理員Rank: 10Rank: 10Rank: 10 收聽TA 發(fā)消息. 4 發(fā)表于 201266 16:03:59 |只看該作者 thanks for sharing... 回復 舉報 . 賴瑋婧 .查看詳細資料321主題 4聽眾 4813積分 論壇元老Rank: 8Rank: 8 收聽TA 發(fā)消息. 　　感謝您的閱讀