冠狀病毒實(shí)驗(yàn)室檢測-資料下載頁
2025-05-26 03:37本頁面
【正文】 以測定核苷酸序列，確定病原需要較好的經(jīng)驗(yàn) 冠狀病毒檢測通用引物對(duì) : CorFW (539。ACWCARHTVAAYYTNAARTAYGC339。) CorRV (539。TCRCAYTTDGGRTARTCCCA3‘) 冠狀病毒通用引物 RTPCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳 Onestep RTPCR assays (OneStep RTPCR kit。 QIAGEN) a 50 μl reaction volume containing 10 μL RNAextract, 10 μl 5x QIAGEN OneStep RTPCR Buffer, 2 μl dNTP mix (final concentration of 400 μM of each dNTP), μl QIAGEN OneStep RTPCR Enzyme Mix (a bination of Omniscript and Sensiscript reverse transcriptase and HotStarTaq DNA polymerase), 4 μM of each primer, and RNasefree water to 50 μl. The reaction was carried out with an initial reverse transcription step at 50176。 C for 30 min, followed by PCR activation at 95176。 C for 15 min, 50 cycles of amplification (30 sec at 94176。 C。 30 sec at 48176。 C。 1min at 72176。 C), and a final extension step at 72176。 C for 10 min 定量 PCR， TaqMan體系 ? ABI 公司首先推出 (PRISM 7000系列 ) 。 ? 實(shí)時(shí)檢測 : 每個(gè)循環(huán)都會(huì)產(chǎn)生與 PCR產(chǎn)物成正比的熒光物質(zhì) 定量 RT PCR檢測 ? 試劑盒： RealTime OneStep RTPCR Master Mix (Applied Biosystems). ? 25μL 反應(yīng)體系含： μL of 2X Master Mix, μL of the 40X MultiScribe and RNase Inhibitor mix, μL of 10 μM probe, μL each of 50 μM forward and reverse primers, μL of nucleasefree water, and 5 μL of nucleic acid extract ? 反應(yīng)條件： 30 min at 48176。 C （反轉(zhuǎn)錄） , 10 min at 95176。 C ； 45 cycles of 15 s at 95176。 C and 1 min at 60176。 C. ? 對(duì)照設(shè)置： HCoV 陽性模板； 2個(gè)陰性模板（核酸提取開始）；無模板對(duì)照（ PCR擴(kuò)增步驟） . ? 陽性結(jié)果判讀 :對(duì)照成立條件下， CT 45 cycles 后續(xù)工作 ? 代獲得全基因組序列后，進(jìn)行進(jìn)一步分析與引物優(yōu)化設(shè)計(jì)驗(yàn)證，研制更好的分子檢測試劑 ? 表達(dá)純化結(jié)構(gòu)抗原，制備單克隆抗體，研制免疫學(xué)檢測試劑 ? 結(jié)合感染病例及相關(guān)樣品，確定實(shí)驗(yàn)室檢測規(guī)程。 SARS是否會(huì)再次出現(xiàn)？ ?? 研究表明 ， SARSCoV是動(dòng)物中 SARS樣冠狀病毒在反復(fù)與人接觸中跨種屬突變后產(chǎn)生的 。 但對(duì)其原始宿主 、 中間宿主 ， 以及如何跨種屬突變?cè)斐扇碎g流行尚不十分清楚 ， SARS再次出現(xiàn)的威脅依然存在 ！ 病毒病應(yīng)急技術(shù)中心簡介 位于昌平區(qū)中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所新址主樓 5層西側(cè)，總面積約為 700平方米，含常規(guī)分子生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、血清學(xué)及 BSLBSL2及 BSL3（主樓 6層）等病原研究實(shí)驗(yàn)室 . 衛(wèi)生部 SARS 參比實(shí)驗(yàn)室設(shè)在本科室內(nèi)；承擔(dān)天花猴痘等重要病毒病的應(yīng)急檢測和相關(guān)的技術(shù)儲(chǔ)備任務(wù)；同時(shí)開展病毒病預(yù)防控制新 技術(shù)及產(chǎn)品的研發(fā)等工作。 謝 謝
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