【正文】 ? 小分子 RNA的調(diào)控作用 –調(diào)整基因表達(dá)產(chǎn)物的類型 mRNA干擾性互補(bǔ) RNA（ mRNA interfering plementary RNA， micRNA） –低水平表達(dá)基因的調(diào)控 小分子 RNA阻遏物在翻譯水平嚴(yán)格控制低水平基因表達(dá) . 真核基因的表達(dá)調(diào)控 . DNA水平的調(diào)控 ? 染色質(zhì)丟失 低等生物及動(dòng)物紅細(xì)胞，不可逆 ? 基因擴(kuò)增 ? 基因重排 基因片段改變原銜接順序，重排為完整的轉(zhuǎn)錄單位 ? DNA甲基化 與基因的表達(dá)成反比關(guān)系 –直接改變基因的構(gòu)型影響轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件結(jié)合 –5′端調(diào)控序列甲基化后與核內(nèi)甲基化 CG序列結(jié)合蛋白結(jié)合 –DNaseⅠ 高敏感區(qū)為去甲基化的標(biāo)志 ? 染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變 組蛋白與 DNA結(jié)合與解離 –非組蛋白與組蛋白競爭結(jié)合 DNA，解除組蛋白對基因表達(dá)的抑制 . 轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控 ? 轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成 :真核生物的 RNA聚合酶識別的不是單純的 DNA序列，而是由一個(gè)通用轉(zhuǎn)錄因子（ transcription factor,TF）與 DNA形成的蛋白質(zhì) DNA復(fù)合物 –TFIID結(jié)合 TATA盒 –RNA聚合酶結(jié)合 TFⅡ D，形成閉合的復(fù)合物 –其它 TF與 RNA聚合酶形成開放的復(fù)合物 ?反式作用因子 ? 真核細(xì)胞內(nèi)序列特異的 DNA（ 815bp）結(jié)合蛋白 ? 可以使基因開放（正調(diào)控）或關(guān)閉（負(fù)調(diào)控） ? 三個(gè)功能結(jié)構(gòu)域： DNA結(jié)合域，轉(zhuǎn)錄活性域，結(jié)合其它蛋白結(jié)構(gòu)域 DNA Structure – Major and Minor Grooves DNA結(jié)合域（ DNAbinding domain） ? 鋅指結(jié)構(gòu)（ Zinc finger motif） ? 同源結(jié)構(gòu)域（ Homodomain） ? 亮氨酸拉鏈（ Leucine zipper） ? 螺旋－環(huán)－螺旋 (Helixloophelix structure) ? 堿性 α 螺旋（ Alkaline αhelix） Zinc Finger Motif HelixTurnHelix Motif Leucine Zipper Leucine Zipper Zipper: every 7th residue is a Leu ? Hydrophobic interface HBonding in a ProteinDNA Interaction 轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域（ transcriptional activation domain） ? 酸性 α螺旋結(jié)構(gòu)域（ acidic α –helix domain） ? 富含谷氨酰胺結(jié)構(gòu)域（ glutaminerich domain） ? 富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域（ prolinerich domain） . 轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控 ? 反式作用因子的活性調(diào)節(jié) –表達(dá)式調(diào)節(jié) 合成后即有活性，不能積累 –共價(jià)修飾 磷酸化、去磷酸化，糖基化 –配體結(jié)合 激素受體 –蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用 復(fù)合物的解離與形成 ? 反式作用因子與順式元件的結(jié)合 ? 反式作用因子的作用方式 –成環(huán) –扭曲 –滑動(dòng) –Oozing ? 反式作用因子的組合式調(diào)控作用 –組合式基因調(diào)控（ conbinatorial gene regulation）幾種反式作用因子組合而發(fā)揮特定作用 . 轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控 ?加帽和加尾的調(diào)控意義 ?選擇剪接的調(diào)控作用 –選擇剪接（ alternative splicing）： exon，intron是否出現(xiàn)在成熟 mRNA是可以選擇的 –Exon選擇， intron選擇，互斥 exon，內(nèi)部剪接位點(diǎn) ? mRNA運(yùn)輸?shù)目刂? . 翻譯水平的調(diào)控 ? 翻譯起始的調(diào)控 –阻遏蛋白的調(diào)控作用 –翻譯起始因子的功能調(diào)控 –AUG對翻譯的調(diào)控 –mRNA5′非編碼區(qū)長度對翻譯的影響 ? mRNA穩(wěn)定性調(diào)節(jié) ? 小分子 RNA對翻譯水平的影響 ?新生肽鏈的水解 ?肽鏈中氨基酸殘基的修飾 ?通過信號肽分揀、運(yùn)輸、定位 . 組織特異性表達(dá)和時(shí)相性 ? Spatial restriction of gene expression (: housekeeping genes) Multiple an/tissue pattern (. SHH in nervous system) Specific tissur, cell lineage or cell type (. betaglobin gene in erythroid cells) Individual cells (. BCR, TCR) Intracellular distribution ? Temporal restriction of gene expression Cell cycle stage ( Developmental stage (. globin gene) Differentiation stage (Collagen genes) Inducible expression 五、 RNA分析 + 核酸雜交： 不同來源 的兩條核酸單鏈由于 具有互補(bǔ)序列 ，在一起復(fù)性時(shí)，互補(bǔ)序列配對，形成雜化分子。 2. 狹縫印跡法 3. 組織原位雜交 4. RNase保護(hù)測定法 5. mRNA引物延伸分析 6. 應(yīng)用單鏈 DNA探針的 S1定位法 7. 設(shè)置內(nèi)參的 RTPCR ? 內(nèi)參基因 : betaactin, GAPDH, rRNA ? RNA制備、逆轉(zhuǎn)錄、 PCR、凝膠電泳、定量測定。 8. 實(shí)時(shí)定量 PCR 六、轉(zhuǎn)錄組學(xué) (transcriptomics) Global mRNA profiling ? 不同組織或細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄的總體特征。 ? 不同組織或細(xì)胞在不同時(shí)間基因的轉(zhuǎn)錄有數(shù)量和表達(dá)程度的差異。 ? 基因表達(dá)模式提供單一基因輔助信息和其它基因的聯(lián)系 。 確定基因和產(chǎn)物的功能途徑和網(wǎng)絡(luò) , 有利于新藥的發(fā)展。 ? 技術(shù)具備 1. cDNA微陣列 2. 差異顯示 PCR (DDRTPCR) ? 3’端引物為 T(11)MN ? 5’端引物為 10個(gè)堿基組成的隨機(jī)引物 ? 分離總 RNA后，行 RTPCR ? 電泳、比較差異 3. 基因表達(dá)序列分析術(shù) (series analysis of gene expression, SAGE) ? 910bp短核苷酸序列 , 含有鑒定一個(gè)轉(zhuǎn)錄物的足移信息。 ? 9bp克隆測序，分析結(jié)果。 4. Massively parallel signature sequencing (MPSS) 5. 代表性差異分析 (RDAPCR) 6. 抑制性消減雜交 (SSH) cDNA文庫 8. EST 數(shù)據(jù)庫比對 RNA常用檢測方法比較 ? 分辯率高 , 通量低 Tissue and cellular in situ hybridization ? 分辯率低 , 通量低 Northern blotting Dot blotting RTPCR Ribonuclease protection assay ? 分辯率低 , 通量高 DNA microarray DDRTPCR SSH SAGE 主要參考文獻(xiàn) ? 馮作化主編 . 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué) . 人民衛(wèi)生出版社 , 2022. ? 劉德培主編 . 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué) . 人民衛(wèi)生出版社 , 2022. ? 馮作化主編 . 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué) . 人民衛(wèi)生出版社 , 2022. ? Brown TA. Genomes 2. Jone Wiley amp。 Sons. InC. 2022 ? Strachan T and Read AP. Human Molecular Geics 3. Garland Publishing, 2022 致謝 : 本幻燈片采用了西交大醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)與 分子生物學(xué)系部分老師的 ppt內(nèi)容，沒有一一 標(biāo)名，對他們付出的勤勞表示感謝！