【正文】 考馬斯亮藍(lán)R25030％(W／V)凝膠貯存液（丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，操作時要戴手套和口罩）丙烯酰胺29g，亞甲雙丙烯酰胺1g, 加ddH2O溶至100ml，用新華3號濾紙過濾，棕色瓶中4℃保存，每隔幾個月須重新配制。TrisHCl， 1．5mol／L／L Tris—HCl，pH 。10％SDS。10％過硫酸銨(AP，新鮮配制)。TEMED(四甲基乙二胺)。Tris甘氨酸電泳緩沖液，可配成5貯存液備用，臨用前稀釋。工作液5貯存液Tris堿25 mmol／LTris堿甘氨酸250mmol／L (pH )甘氨酸94gSDS％1％SDS50ml加ddH2O 至1000ml樣品處理液Deionized water ml M TrisHCl, pH mlGlycerol ml10% (w/v) SDS ml2mercaptoethanol ml1% (w/v) bromophenol blue ml染色液 ％考馬斯亮藍(lán)—R250染色液。甲醇400m1冰乙酸100ml考馬斯亮藍(lán)R2501gddH2O加至1000m1脫色液甲醇400ml冰乙酸100mlddH2O500ml操作步驟1將凍存的含有組表達(dá)載體pETB1, 空表達(dá)載體pET28b的大腸桿菌BL21畫線接種在LB平板上，37度培養(yǎng)過夜，直至平板上長出單菌落。2 挑取單菌落至5mlLB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600=。4度放置過夜。3 取2ml培養(yǎng)菌加入到48ml培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600=。4 表達(dá)載體和重組載體都分別設(shè)置誘導(dǎo)組與不誘導(dǎo)組，誘導(dǎo)組加入終濃度為1mM的IPTG，不誘導(dǎo)組不加IPTG。25度誘導(dǎo)培養(yǎng)12h。5 ，5000rpm離心1分鐘，收集細(xì)菌。6 用1ml 10mM TrisHCl（）懸浮細(xì)菌，5000rpm離心1分鐘，收集細(xì)菌。7 加入30ul的 10mg/ml的溶菌酶，充分懸浮，4度放置2小時以上。8 制備4%濃縮膠，12%的分離膠的SDSPAGE膠。按下表制備濃縮膠水30%丙烯酰胺溶液／L TrisHCl pH 10％SDS10％APTEMED按下表制備分離膠9 超聲處理5分鐘，每30秒間隔50秒，12000rpm離心10分鐘，取上清作為蛋白樣品。10 渠5ul測定蛋白濃度。11 取50ug蛋白上樣，加入5ul上樣緩沖液，沸水浴5分鐘，瞬時離心后上樣。12 170V恒壓電泳至溴酚藍(lán)至凝膠前沿。13 染色1小時14 脫色至條帶清晰，背景明亮為止。結(jié)果： 誘導(dǎo)的pETB1菌液樣品在分子量61kDa處有一明顯的深厚條帶，而其他三種處理沒有此條帶。影響蛋白質(zhì)電泳分離效果的因素 1．蛋白質(zhì)樣品中的鹽濃度 影響蛋白條帶的遷移率和帶型，因此為消除鹽濃度的影響，溶解蛋白時最好用去離子水，再加等量2SDSPAGE樣品緩沖液，必要時經(jīng)過透析或進(jìn)行Sephader G25過柱。 2．SDS的質(zhì)量 由于變性蛋白是與SDS結(jié)合而帶負(fù)電荷，蛋白結(jié)合SDS的量與蛋白質(zhì)的分子量成正比，因此質(zhì)量不同的SDS，相同的蛋白質(zhì)樣品，將可能出現(xiàn)不同遷移率的電泳圖譜。 3．上樣孔是否平齊，若上樣孔不平齊，也影響蛋白電泳的遷移率。299 4．為防止相鄰泳道樣品的擴(kuò)散，而導(dǎo)致電泳條帶的不整齊，如有空置的加樣孔，須加等體積的空白1SDS樣品緩沖液。 電泳樣品的準(zhǔn)備1．濃度 單一成分1—10μg，若濃度太稀，應(yīng)沉淀后再進(jìn)行電泳；對于非單一成分的樣品，如基因工程大腸桿菌的表達(dá)產(chǎn)物，其蛋白量50～100μg可取得較好的分離效果。 2．體積 樣品體積盡可能小，以保證電泳條帶的整齊，必要時可應(yīng)用6SDS加樣緩沖液以增加蛋白質(zhì)的加樣量。 3．鹽濃度應(yīng)盡可能低，可用SephaderG25快速脫鹽；鉀離子(K+)要除去，因為鉀離子沉淀SDS。 4．分離小分子肽時，分離膠的濃度可提高到20％～25％。5. 對照孔加入蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)樣品，同樣也須1000C處理 3～5min。注意事項1. 丙烯酰胺單體和交聯(lián)劑N，N′—亞甲基雙丙烯酰胺有神經(jīng)毒性，在稱量和配制時要帶一次性手套，稱量時最好也戴上口罩。2. 凝固后一般不再有毒性，但考慮到存在沒有完全交連的分子，實驗結(jié)束后不宜直接用手拿取，要先用清水漂洗510分鐘。3. 室溫較低時膠液不易凝固，可以在槽中加370C溫水。4. SDS很容易漂浮在空氣中而吸入體內(nèi)，稱量時最好在通風(fēng)櫥中進(jìn)行，或戴上口罩。5. 在實際操作中，很容易將電極接反，請注意，負(fù)極永遠(yuǎn)接在加樣孔的一端（即上負(fù)下正）。實驗十一 RNA的提取及其純度檢測實驗?zāi)康模?了解Trizol提取總RNA的原理，掌握高質(zhì)量完整總RNA提取的技術(shù)以及電泳變性膠電泳檢測和濃度及純度鑒定方法。實驗原理 Trizol是一種酚與異硫氰胍的混合物，非常容易把組織和細(xì)胞中的總RNA提取出來。在加入氯仿離心后，RNA保留在水相中，與DNA和蛋白質(zhì)分離開來（保留在有機(jī)相中）。吸取水相，加入異丙醇成淀RNA，從而得到完整純度高的總RNA。實驗內(nèi)容材料 小鼠新鮮肝試劑 總RNA提取純化試劑：Trizol(Invitrogen)；DEPC(Amersham)，無水乙醇，已丙醇；電泳試劑：MOPS，甲酰胺，甲醛，上樣緩沖液（50%甘油，10 mM EDTA，% 溴酚藍(lán)，%二甲苯青），瓊脂糖。操作步驟總RNA的提取1小鼠肝組織的勻漿裂解斷頸處死小鼠，立即解剖取出肝臟，取50100mg到玻璃勻漿器中，假如1mlTrizol反復(fù)勻漿膜碎組織，使細(xì)胞完全裂解。按1 ml ml氯仿，震蕩15秒，室溫放置3分鐘，12000g，4℃離心15分鐘。2 RNA的沉淀將離心的上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中，按1 ml ，震蕩15秒，室溫放置10分鐘，12000g，4℃離心10分鐘。3 RNA的洗滌與溶解吸掉上清，加入1 ml 75% 乙醇洗滌沉淀，4℃，7500g離心5分鐘。吸掉上清，空氣干燥RNA沉淀10分鐘，加入適量的DEPC處理水溶解RNA，立即電泳和紫外濃度和純度鑒定，剩余20℃保存?zhèn)溆谩Ｔ诤屑兹┑哪z上進(jìn)行的RNA電泳甲醛蒸氣有毒，含有甲醛的溶液應(yīng)在化學(xué)通風(fēng)櫥內(nèi)配制，裝有甲醛溶液的電泳槽應(yīng)盡可能蓋嚴(yán)。配制5甲醛凝膠電泳緩沖液： 5甲醛凝膠電泳緩沖液 ／L MOPS（pH7．O） 40mmol／L 乙酸鈉 5mmol／L EDTA（pH ) 將20．6g 3(N瑪琳代）丙磺酸（MOPS)溶于800ml經(jīng)用DEPC處理的50mmol/L乙酸鈉溶液（用DEPC處理溶液的方法見344頁）。用2mol/,加10ml經(jīng)用DEPC處理的0．5mol／L EDTA(pH ）， ，避光保存于室溫。光照或高壓后溶液逐漸變黃，淡黃色的緩沖液可正常使用，而深黃色緩沖液則不然。 小心：DEPC有致癌之嫌，須小心操作。制備凝膠：將適量瓊脂糖熔于水，冷卻至60℃，加入5甲醛凝膠電泳緩沖液和甲醛至終濃度分別為1和2．2mol／L（將12．3mol／L甲醛貯存液、瓊脂糖水溶液和5甲醛凝膠電泳緩沖液按1：3．5：）。在化學(xué)通鳳櫥內(nèi)灌制凝膠。于室溫放置30分鐘或更長時間，使凝膠凝固。 甲醛（）通常為37％的水溶液（／L），. 在一滅菌的微量離心管內(nèi)混合下列液體，以制備樣品： RNA（多達(dá)30ug) 4ul 5x甲醛凝膠電泳緩沖液 21ul 甲醛 甲酰胺 于65 C溫育15分鐘，冰浴冷卻，離心5秒鐘使管內(nèi)所有液體集中于管底。 加2ul滅菌的并經(jīng)用DEPC處理的甲醛凝膠加樣緩沖液。 甲醛凝膠加樣緩沖液 50％ 甘油 1mmol／L EDTA（pH8．0） 0．25％ 溴酚藍(lán) ％ 二甲苯青FF 加樣前，將凝膠預(yù)電泳5分鐘，電壓降為5V／cm，隨后將樣品加至凝膠加樣孔。將凝膠浸入1甲醛凝膠電泳緩沖液中，34V／cm電壓降進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后浸入溴化乙錠溶液（0．5ug／m1，用0．1mol／L乙酸銨配制）中染色3045分鐘。 與未變性的瓊脂糖凝膠相比，含甲醛的凝膠較為脆弱，故應(yīng)小心操作。結(jié)果在凝膠上可以看到一般可以看到三條帶，其中從上樣孔開始對應(yīng)的帶的分別是28S,18S和5S，其中18S和28S的條帶明顯清晰，而5S的帶比較弱，28S的帶的亮度是18S帶亮度的2背左右，說明RNA保持完整。紫外分光光度法測定RNA的濃度和純度總RNA用10mM的TrisHCl()稀釋，利用紫外分光光度計測定A260和A280值，根據(jù)1OD=40ug定量,并計算A260/A280比值，每一樣品重復(fù)3次。如果A260/（－），說明RNA的純度很好。注意事項創(chuàng)造無Rnase的環(huán)境注意以下幾點，以防止Rnase污染樣品，保證分離到全長mRNA： 手和空氣中的細(xì)菌霉菌是主要的Rnase污染源。為防止污染，應(yīng)在超凈臺上無菌操作。這些試劑都要反復(fù)使用，所以開啟和關(guān)閉試劑瓶一定防止污染。一直帶塑料手套。最好用一次性使用塑料制品提RNA，這些制品常是無RNase的，無須滅活RNase。不是一次性使用的玻璃和塑料制品，用前應(yīng)除RNase。玻璃制品應(yīng)于200℃烘烤過夜， NaOH，1mM EDTA作徹底沖洗，再用無RNase水沖洗。%DEPC處理過夜，再高壓滅菌30分鐘以出去痕量DEPC。實驗十二 逆轉(zhuǎn)錄PCR（RTPCR）擴(kuò)增基因特異片段實驗?zāi)康? 了解RTPCR的原理，掌握 RTPCR擴(kuò)增基因的特異片段的技術(shù)。實驗原理 PCR（Polymerase Chain Reaction；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）是一種體外擴(kuò)增DNA的簡單而有效的方法。雖然原理上PCR法是擴(kuò)增DNA，RNA不能直接被擴(kuò)增，但是經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄酶的作用把RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，PCR法便可應(yīng)用于RNA的解析了。迄今為止，此方法已廣泛應(yīng)用于RNA的構(gòu)造解析、cDNA的克隆及RNA水平上的表達(dá)解析等多種領(lǐng)域。編碼蛋白質(zhì)的基因在轉(zhuǎn)錄后形成mRNA，mRNA 翻譯后編碼產(chǎn)生蛋白質(zhì)。真核生物的mRNA 的3端有多個腺苷酸，形成寡聚腺苷酸的尾巴，因此可以與Oligo dT結(jié)合，在反轉(zhuǎn)錄的作用下形成cDNA。再通過基因的特異引物PCR擴(kuò)增得到基因的特異片段，此方法稱為2步法。也可以根據(jù)已知基因的序列設(shè)計引物，以基因的特異引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到特異基因的cDNA，以此為摸板PCR擴(kuò)增得到特異基因片段，由于此法轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增在同一反應(yīng)管中進(jìn)行，轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增的引物相同，因此稱為一步法。One Step RTPCR的原理一步法的優(yōu)點：實驗內(nèi)容材料 小鼠新鮮肝試劑 總RNA提取純化試劑：Trizol(Invitrogen)；DEPC(Amersham) 無水乙醇，已丙醇； RTPCR試劑盒 TaKaRa One Step RNA PCR Kit (AMV)（大連寶生物生物公司）本試劑盒采用了一步反應(yīng)法（One Step法）完成RTPCR反應(yīng)。RNA→cDNA→PCR反應(yīng)操作在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行，反應(yīng)中途不需添加任何試劑，就可以完成由AMV（Avian Myeloblastosis Virus）由來的反轉(zhuǎn)錄酶從RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再由AMVOptimized Taq擴(kuò)增cDNA的全部反應(yīng)。本試劑盒中含有進(jìn)行One Step法RTPCR反應(yīng)用的全部試劑，可以簡便而有效地對RNA進(jìn)行擴(kuò)增分析。本試劑盒中的Control RNA是以pSPTet3質(zhì)粒（ kbp的pBR322來源的DNA片段，其DNA片段上含有抗四環(huán)素基因）為模板由SP6 RNA聚合酶經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄而得到的。Control RNA（ kb）是帶有30個A堿基的具有Poly(A)+尾的RNA。當(dāng)把Control RNA經(jīng)RTPCR合成的雙鏈cDNA插入質(zhì)粒時，該質(zhì)粒便可獲得四環(huán)素抗性。操作步驟1總RNA的提取根據(jù)上次實驗總RNA的提取進(jìn)行。2 按下列組成配制RTPCR反應(yīng)液。3 按以下條件進(jìn)行RTPCR反應(yīng)。當(dāng)RNA為Positive Control RNA時，反應(yīng)條件如下。4反應(yīng)結(jié)束后，取PCR反應(yīng)液 (5 –10ul) 進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)RTPCR反應(yīng)產(chǎn)物。如果此PCR產(chǎn)物需用于以后實驗，應(yīng)將PCR產(chǎn)物冷凍保存。Control反應(yīng)時擴(kuò)增片段大小為462 bp。思考題 一步法和兩步法RTPCR的有何差別，在實際應(yīng)用上體現(xiàn)在哪些方面？實驗十三 DNA探針制備實驗?zāi)康? 了解雙鏈DNA的缺口平移和隨機(jī)引物標(biāo)記法的原理以及掌握其技術(shù)。實驗原理在基因分析的雜交方法中幾乎都用到同位素或非同位素標(biāo)記的探針。制備探針的方法有DNA缺口平移標(biāo)記、隨機(jī)引物標(biāo)記、DNA末端標(biāo)記、寡核苷酸末端標(biāo)記、引物延伸法標(biāo)記、RNA探針標(biāo)記以及非同位素標(biāo)記等。每一種標(biāo)記方法有各自的特點和適用范圍