【正文】 ，可在每20 m1銀液內(nèi)加氨液4滴；%氫氧化鈉于銀液中。（8）切片速經(jīng)水洗，浸于1%硫代硫酸鈉1min，再用蒸餾水洗數(shù)次。（9）用Albrecht明膠乙醇法封片。Albrecht明膠乙醇封片法：%明膠及80%乙醇約5min ，將切片撈于載玻片上，使用新濾紙略吸干。入95%乙醇最后凝固明膠。（10）脫水、透明、封片?！窘Y(jié)果】 粗細不一的潰變纖維均染成黑色，背景黃褐色。但有一些正常軸索被鍍銀成黑色。潰變纖維所終止的細胞可見有潰變的細胞周圍或樹突周圍纖維。胞體及樹突近側(cè)端染成淡褐色。第四章 色 素 類第一節(jié) 黑 色 素一、黑色素的基本概念、形成機制和分布黑色素從字義上是一種黑色的色素，但實際上這種色素在顯微鏡下通常不呈黑色，而呈黃棕色或棕褐也，其顆粒大小不一。 黑色素在黑色素母細胞內(nèi)合成，黑色素母細胞起源干神經(jīng)脊，在胚胎發(fā)育過程中，由神經(jīng)脊移行到皮膚、眼和中樞神經(jīng)系統(tǒng)。因此，在正常情況下，皮膚的表皮、毛囊、眼的虹膜、睫狀體、脈絡(luò)膜，腦的軟腦膜、黑質(zhì)、藍斑、迷走背核，以及交感神經(jīng)節(jié)和脊神經(jīng)節(jié)的節(jié)細胞內(nèi)均可有黑色素沉著。在病理情況下可能在全身各處含有黑色素沉著物。黑色素母細胞的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體是形成黑色素的場所，他們以酪氨酸為原料，在酪氨酸酶的氧化作用下，經(jīng)過一系列變化形成黑色素。 二、黑色素的病理診斷分類和染色的應(yīng)用。用于黑色素的診斷 在疑為黑色素瘤，尤其是未分化的腫瘤組織中，或在淋巴結(jié)內(nèi)的腫瘤細胞中，證實有黑色素時，往往要考慮為黑色素腫瘤。另外當黑色素很少時，黑色素染色可使黑色素容易發(fā)現(xiàn)。當病變時黑色素含量多時，可用漂白法以便視察核的結(jié)構(gòu)和核分裂現(xiàn)象以利診斷。其它 色素性神經(jīng)瘤、透明細胞肉瘤也有黑色素存在，皮病性淋巴結(jié)炎時，淋巴結(jié)內(nèi)也可有黑色素沉著。皮膚病 有黑色棘皮病、老年疣、白癜風(fēng)、色素性蕁麻疹、瑞爾黑變病、網(wǎng)狀色素性皮膚異色病、紅斑狼瘡、扁平苔蘚和許多內(nèi)分泌代謝性疾?。ò⒌疑　⒏尾〉龋?，這些疾病的皮膚中都有色素沉著或脫失。但是在染色應(yīng)用上，只是用必要的情況下用黑色素染色法。神經(jīng)黑色素 中樞神經(jīng)系統(tǒng)的黑質(zhì)、藍斑以及其它部位神經(jīng)細胞的色素和皮膚的黑色素稍有區(qū)別，又稱神經(jīng)黑色素。Graham(1979年)指出它們不是通過酪氨酸酶的作用形 成，而是兒苯酚胺代謝的產(chǎn)物，這些神經(jīng)細胞沒有通過黑白素母細胞的黑色素小體。色素的量也隨年齡而增加，但色素本身并不會引起神經(jīng)元的變性。提示這種色素通過黑色素染色法，可供神經(jīng)研究的參考。假性黑變病色素 這種假性黑變病色素主要見于大腸，闌尾和小腸次之，故又稱為結(jié)腸黑變病。在臨床上見嚴重便秘和習(xí)慣用鼠李皮作緩瀉劑者。在固有膜巨噬細胞內(nèi)有一種性質(zhì)不明的色素，普魯士藍反應(yīng)弱陽性，PAS陽性。有人認為是含鐵血黃素與腸道內(nèi)細菌所產(chǎn)生的硫化氫相作用而形成的硫化鐵；也有人認為是腸道內(nèi)吸收的蛋白質(zhì)分解而生成的黑色素、脂褐素相似的物質(zhì)。經(jīng)過黑色染色可以得到證明。但還需用別的色素法作為對照用。三、黑色素在固定和染色方面的問題 黑色素是不含鐵而含硫的色素，這種色素是十分穩(wěn)定的物質(zhì)，完全不溶于水及有機溶劑，但是長時間在強堿中則可被溶解。所以黑色素組織非常容易保存，采用一般的固定和石蠟包埋均不會丟失。根據(jù)黑色素的性質(zhì)通過強氧化劑可使之脫色，再用氨銀液可將其還原為金屬銀的能力，使之呈現(xiàn)黑色。應(yīng)指出的是，有一些黑色素用PAS反應(yīng)可呈陽性結(jié)果，曾有作者在一例透明細胞肉瘤中見到PAS陽性的黑色素反應(yīng)。根據(jù)Lillie(l957年)發(fā)現(xiàn)黑色素能和亞鐵離子結(jié)合(鰲合)，使黑色素先在FeSO4中形成亞鐵的黑色素化合物，再用滕波爾反應(yīng)，就可以利用這個非敏感的反應(yīng)移植到顯示黑色素(呈深綠色)的技術(shù)方法中。除了用染色的復(fù)合試劑顯示以外，還可用單一的漂白法來證明黑色素是存在還是被去除。常用的有過氧化氫、高錳酸鉀、過乙酸、過甲酸、三氯化鐵等，可將黑色素的酚環(huán)打開而使黑色素脫色。 Masson Fontana 銀浸法(1929年)[固定] 10%中性甲醛液或乙醇液，不能用含有鉻酸鹽的固定液固定。[試劑配制] Fontana銀液：用l0%硝酸銀水溶液20ml，逐滴加入濃氨水，至沉淀消失呈微乳白質(zhì)，加蒸餾水20ml。此液貯存在棕色蘑口瓶內(nèi)，置暗處過24h后可才應(yīng)用，如果此溶液貯存在冷暗處，可保存1個月，但最好于2周內(nèi)使用。[染色方法] (l)切片脫蠟至水。(2)用蒸餾水充分洗滌。 (3)投入Fontana銀液，置于室溫下暗處18~48h。 (4)經(jīng)蒸餾水洗數(shù)次。 (5)%氯化金水溶液處理5min。 (6)蒸餾水洗3min (7)用5%硫代硫酸鈉水溶液固定2min。 (8)流水沖洗2min。(9)用1%藏紅花紅或Van Gieson染色1min。(10)自來水洗1min。(11)95%、無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。[結(jié)果] 黑色素及嗜銀細胞顆粒雖黑色；角蛋白呈橙色；其它呈復(fù)染色。Lillie亞鐵反應(yīng)法 [固定] 10%甲醛及Carnoy液，不用含鉻鹽的固定液。[試劑配制] (1)硫酸亞鐵溶液 硫酸亞鐵(FeSO47H2O)，蒸餾水100ml。(2)醋酸鐵氰化鉀溶液 1%醋酸水溶液100ml，鐵氰化鉀1g。[染色方法] (l)切片脫蠟至水。 (2)硫酸亞鐵溶液中浸60min。 （3）用蒸餾水洗20min（需更換3次）。 (4)在醋酸鐵氰化鉀溶液中染30min。 (5)用1%醋酸液分化。(6)入Van Gieson液中復(fù)染30s。(7)95%、無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固或DPX封固。[結(jié)果] 黑色素呈暗綠色；背景淺綠或不著色。用VG復(fù)染時，膠原纖維呈紅色，肌肉和胞漿黃色和褐色。含鐵血黃素用此染色法也能呈陽性，可結(jié)合鐵反應(yīng)法來鑒別。Dopa黑色素反應(yīng)法 本法為經(jīng)過Laidliw修正之Bloch法（1932年）。我們要求采取新鮮組織或組織固定于5%甲醛液(至多固定2~3h)。用冰凍切片。為預(yù)防反應(yīng)作用受影響，冰凍切片浸水時間不超過數(shù)秒鐘。[試刑配制] (1)Dopa貯藏液：%3，4一二羥苯丙氨酸（Dopa）于100或200ml蒸餾水。緊閉瓶口，放入冰箱，可保存數(shù)周。此液呈深紅色時即失效。 (2)緩沖液 溶解磷酸氫二鈉(Na2HPO42H20)]11g于1000ml蒸餾水中(甲液)，溶解磷酸二氫鉀(K H2PO4)9g于1000ml蒸餾水中（乙液）。甲、乙兩液分別貯藏于冰箱。 臨用時，取甲液6ml及乙液2 ml與25ml Dopa貯藏液混合，即成染液。在一定之溫度中，反應(yīng)速度以pH值為轉(zhuǎn)移。，℃時，則反應(yīng)在4~5h內(nèi)完成，若于配制染液時改用乙液lml，；若完全不用乙液，在此堿性溶液中，溫度不變則反應(yīng)在1h內(nèi)完成。但此加速法促成組織濃染，用緩饅反應(yīng)可靠?；谏鲜鲈?，使用微量堿性之玻璃皿器亦有濃染趨勢；使用微量酸性者則不發(fā)生反應(yīng)，因此，所用一切皿器必須沒有酸堿性反應(yīng)，絕對保持皿器清潔。 [染色方法] (1)浸切片于Dopa緩沖染色液約30min，℃。 (2)更換l次染液(預(yù)先貯藏冰箱中者)。 (3)每30min鏡檢1次，2~3h后染液變紅色，3~4h后染液變棕色，亦即切片染色適宜之表現(xiàn)。 (4)水洗。 (5)95%乙醇、無水乙醇脫水，二甲苯透明，封固（人工膠最好）欲染配色，先洗于水。%焦油紫水溶液染色，以95 %乙醇分化，或用結(jié)晶紫乙醇液染配色也可(Cowdry)。 [結(jié)果] Dopa陽性反應(yīng)細胞漿（黑素母細胞及白細胞）呈灰色至黑色，黑素不改變顏色，膠原纖維無色或呈淺灰色。 脫色素漂白法 顯示黑色素的染色方法是將其染成某種顏色，以便觀察及判定。而脫黑色素的方法，則是從另一方面驗證染色所顯示的結(jié)果是否就有黑色素。其方法概括起來就是將要顯示黑色素的連續(xù)切片、應(yīng)用氧化劑的氧化及漂白處理。使黑色素被脫色。然后再用顯示黑色素的染色方法加以證明為陰性結(jié)果。通常采用此法來證實是否有黑色素存在時，切制3張連續(xù)石蠟切片，一張作HE染色，一張作黑色素染色，一張用氧化漂自脫色素法。 [脫色方法] (1)氯化鉀乙醇鹽酸法 氧化鉀1g，70%乙醇50ml，濃鹽酸1ml。在立式染色缸中進行3h。 (2)高錳酸鉀草酸法 %~%高錳酸鉀溶液，處理切片2~4h，水洗后用1%草酸處理lmin。(3)溴水脫色法 用1%溴水溶液處理切片12~24h。(4)鉻酸脫色法 用1%鉻酸水溶液與5%CaCl2水溶液之等量混合液處理切片8~l2h。(5)過氧化氫脫色法 用10%過氧化氫液處理切片24~48h。(6)過醋酸脫色法 用40%過醋酸水溶液處理2~16h。在上述脫色后，經(jīng)過水洗5~l0min，根據(jù)需要進行染色，常規(guī)脫水、透明及封固。在進行氧化漂白處理過程中，應(yīng)隨時取出鏡檢，使細胞內(nèi)外之黑色素完全消失為主。第二節(jié) 脂 褐 素一、脂褐褐的基本概念、形狀和存在特點脂褐褐又稱為棕色萎縮性色素或消耗性色素。脂褐素是一種微細的，大小一致呈小滴狀的淺棕色或金黃色的顆粒。以往認為脂褐素是從一脂類或脂蛋白衍生而來。近年來有人通過研究進上步認為脂褐素是一種衰老或破壞了的線粒體、內(nèi)織網(wǎng)等細胞器通過溶酶體的消化而尚未完全消失掉的殘余物。脂褐素主要見于老年人或者患慢性消耗性疾病者，尤以心肌和肝細胞最多見。在心肌纖維中堆積在核的兩端，肝細胞中則在核周圍。其次在睪丸、卵巢、腎上腺網(wǎng)狀帶、精囊和神經(jīng)節(jié)細胞等處亦可出現(xiàn)。色素的數(shù)量、分布范圍均隨年齡的增大而增加，或同病程的增加而增多。脂褐素又分為早期脂褐素和晚期脂褐素。早期脂褐素能保持脂類所有的染色特性，因此用蘇丹黑B 法可染成灰黑色，油紅染色也呈陽性反應(yīng)。晚期脂褐素是經(jīng)完全氧化后的色素，因而失去其嗜染蘇丹和油紅性，但卻具有更大的還原性能力，顯示此種脂褐素方法較多，都是以相互比較進行鑒別診斷。 二、脂褐素染色的應(yīng)用 用于老年病的診斷和研究 在老年性萎縮性心肌組織、肝組織、睪丸和卵巢等臟器的細胞內(nèi)，均可出現(xiàn)較多的脂褐素。 與膽色素、含鐵血黃素等鑒別 也需應(yīng)用脂褐素染色法進行顯示觀察來診斷。用于顯示和觀察長期消耗性疾病和惡性腫瘤等 上述疾病都會引起脂褐素沉著物。三、具體染色方法Schmoil反應(yīng)法[固定] 顯示脂褐素和黑色素，任何固定液均可。顯示嗜銀顆粒用10%甲醛生理鹽水。顯示嗜鉻顆粒，用不含醋酸的重鉻酸鹽固定液。[試劑配制] (1)三氯化鐵溶液，三氯化鐵1g，蒸餾水100 ml。(2)鐵氰化鉀溶液 鐵氰化鉀1g，蒸餾水100ml。(3)應(yīng)用液，。此溶液必須新配。在30min內(nèi)使用。[染色方法](1)切片脫蠟至水。 (2)入新配制的應(yīng)用液內(nèi)，30s至Smin。(3)自來水沖洗。 (4)入1%醋酸水內(nèi)2min。(5)充分自來水沖洗。(6)入1%中性紅對比染色2min。(7) 自來水沖洗。(8)逐級乙醇脫水，透明，DPX封固。 [結(jié)果]脂褐素呈綠色至暗藍色；黑色素呈深藍色；嗜銀細胞顆粒呈藍色；嗜鉻細胞顆粒呈綠藍色；細胞核呈紅色。 [注意事項] (1)此法能顯示任何可還原鐵氰化物，對脂揭素并非特異的。 (2)由于一般組織中有少量的還原劑，背景很快就著色，因此，染色應(yīng)控制在最恰當而短的時間。所以切片在染液內(nèi)30s以后就應(yīng)用顯微鏡觀察著色情況、脂褐素和黑色素在2min左右應(yīng)著色。其它還原物質(zhì)，如嗜鉻顆粒由于其還原鐵氰化物的能力較弱，染色時間相應(yīng)加長，著色較綠。 (3)如果組織內(nèi)有二價鐵，將出現(xiàn)假陽性。 (4)可用1%硝酸鐵代替三氯化鐵作反應(yīng)劑。 (5)1%鐵氰化鉀水溶液，必須新配制，不要使用貯存不久的溶液，該液與三氯化鐵水溶液混合后，呈棕色者才好用。 高碘酸無色復(fù)紅法 [試劑配制] 無色復(fù)紅液：堿性復(fù)紅1g，蒸餾水200ml，lM鹽酸20ml。 (1)用一個500m1三角燒瓶盛蒸餾水200m1，煮沸后取出。 (2)加入堿性復(fù)紅1g于煮沸后的蒸餾水內(nèi)(不要在煮沸時立即加入，否則在傾入堿性復(fù)紅徹底溶解，此時溶液為深紅色)。(3)待冷至約50℃時，過濾至另一個三角燒瓶內(nèi)。 (4)加入lM鹽酸20ml，稍搖勻。(5)℃時，用膠塞塞緊，并稍輕搖動促其溶解。此時堿性復(fù)紅液的顏色將變淡。(6)置于暗處24h，此時溶液應(yīng)呈淡紅色或淡稻草黃色。 (7)，搖動1~2min后靜置1~2min時；過濾于棕色小口砂塞瓶內(nèi)。此時溶液應(yīng)完全無色，故稱無色復(fù)(品)紅液。(8)置于冰箱保存待用。臨用時提前從冰箱取出恢復(fù)至室溫。 [染色方法](1)組織固定于10%甲醛液，按常規(guī)脫水包埋。 (2)切片脫蠟至水。(3)%高碘酸水溶液氧化5~8min。(4)流水沖洗2min，再用蒸餾水洗1次。(5)入無色復(fù)紅液內(nèi)，于室溫下