漢恒生物無縫克隆試劑盒使用說明(附原理)-資料下載頁
2025-04-04 23:32本頁面
【正文】 細胞，效果更佳)。. 取2 ml 第3步中的反應樣品加入融化好的感受態(tài)菌中，輕輕混勻，不能震蕩混勻。將該混合物置于冰上30 min。. 輕輕搖勻后放入42℃水浴中1~2 min進行熱激，然后迅速放回冰中，靜置3~5min。. 在超凈工作臺中向上述各管中分別加入500 μl LB培養(yǎng)基（不含抗菌素）輕輕混勻，然后固定到搖床的彈簧架上37℃震蕩1h，搖床轉速250 rpm。. 在超凈工作臺中取上述轉化混合液100~300 μl，分別滴到含合適抗菌素的固體LB平板培養(yǎng)皿中，用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻（注意：玻璃涂布棒上的酒精熄滅后稍等片刻，待其冷卻后再涂）。37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。. 挑取平板上的克隆進行PCR或者酶切鑒定。 Gibson Assembly拼接DNA的原理說明DCBA1. 包含重疊區(qū)域的DNA片段均勻混在一起，Mix內的5‘外切酶可以從5’端消化DNA雙鏈中一條鏈（A）；2. 重疊區(qū)域的DNA形成單鏈，在50176。C配對（這一步不需要酶的參與）（B）；同時外切酶的活性在50176。C會逐漸喪失；3. DNA聚合酶從5‘3’方向延伸（類似PCR中引物結合之后的延伸步驟）（C）；4. 新延伸的鏈末端（3‘）和之前被5‘外切酶消化的鏈末端（5’）接觸，在DNA連接酶的作用下缺口連接一起，形成完好的鏈。至此拼接完成（D）。
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