dnaextraction法醫(yī)學(xué)-資料下載頁
2025-01-19 07:48本頁面
【正文】 E AT 260 nm – ETHIDIUM BROMIDE DNA QUANTIFICATION ? SLOT BLOT QUANTIFICATION – SPECIFIC FOR HUMAN OR PRIMATE DNA – D17Z1 ? RADIOACTIVE ? COLORIMETRIC ? CHEMILUMINESCENT DNA QUANTIFICATION ? CAPTURE GENOMIC DNA ON NYLON MEMBRANE ? ADD D17Z1 PROBE ? INTENSITY OF SAMPLE COMPARED TO STANDARDS ? SENSITIVE TO ~ 150 pg DNA or 50 copies of genomic DNA DNA QUANTIFICATION ? PICOGREEN MICROTITER PLATE ASSAY – USED FOR HIGH THROUGHPUT METHODS – 96 WELL PLATES – AUTOMATED PROCEDURE – SENSITIVE TO ~ 250 pg DNA – 80 SAMPLES ANALYZED IN 30 MINUTES – NOT HUMAN SPECIFIC (BACTERIA CONTAMINATION) DNA QUANTIFICATION ? PCR AMPLIFICATION PICKY – TO ng DNA ? 1 ng DNA roughly equals 333 copies – ~ 167 CELLS ? EACH DIPLOID CELL has roughly 6 pg DNA ? EACH HAPLOID CELL has roughly 3 pg DNA QuantiBlot Human DNA Quantitation Kit ? Slot Bloting AluQuant? ? AluQuant? 采用二步溫育定量人類 DNA。 第一步溫育時發(fā)生焦磷酸化反應(yīng)，它是 DNA聚合反應(yīng)的逆反應(yīng)，一種稱為 READase? 的聚合酶催化雙鏈 DNA 的 339。末端加上一個焦磷酸鹽，導(dǎo)致 339。末端的堿基以 dNTP的形式釋放出來。dNTP在 READase? 激酶的作用轉(zhuǎn)化為 ADP、ATP。 第二步溫育時，在 ATP和熒光素酶(luciferase)的作用下，熒光素 (luciferin)發(fā)光，測定光強度定量 ATP的量。 AluQuant原理 Real Time PCR ? 所謂的實時熒光定量 PCR 就是 通過對 PCR 擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測從而實現(xiàn)對起始模板定量及定性的分析。在實時熒光定量 PCR 反應(yīng)中，引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著 PCR 反應(yīng)的進(jìn)行， PCR 反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖 。 ? 一般而言，熒光擴增曲線擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段 , 熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，我們無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期，擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加。 PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段， PCR 產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個階段進(jìn)行定量分析。 ? 為了定量和比較的方便，在實時熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和 CT 值。熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設(shè)定的一個值，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴增階段任意位置上，但一般我們將熒光域值的缺省設(shè)置是 315 個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10 倍。每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為 CT 值（ threshold value ） ? CT 值與起始模板的關(guān)系研究表明，每個模板的 CT 值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多， CT 值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)代表 Ct 值（如圖 3 所示）。因此，只要獲得未知樣品的 Ct 值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。
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