植物細胞工程中國藥科大學生物工程所有-資料下載頁
2025-01-18 02:06本頁面
【正文】 生 雜合細胞。 1）雜種細胞的選擇系統(tǒng) ? 外觀選擇 ? 互補選擇 ? 熒光標記選擇 4. 雜種細胞選擇系統(tǒng)與雜種植株鑒定 2 ）體細胞雜種的鑒定 形態(tài)鑒定 ：根據(jù)雙親的形態(tài)學性狀觀察進行鑒定。 細胞學鑒定 ：細胞器鑒定、染色體鑒定。 生化鑒定 ：同功酶鑒定。 分子鑒定 ： RFLP鑒定、 RAPD標記鑒定。 4 雜種細胞選擇系統(tǒng)與雜種植株的鑒定 ? RFLP ? 基因型之間 限制性片段長度 的差異 ? ? RAPD ? 建立在 PCR基礎(chǔ)之上的一種可對 整個未知序列 的基因組進行 多態(tài)性分析 的分子技術(shù) 4 雜種細胞選擇系統(tǒng)與雜種植株的鑒定 原生質(zhì)體培養(yǎng) 1~3天， 細胞壁再生 再生細胞一旦分裂，繼續(xù)生長 1 形成 細胞團 ，發(fā)育成 愈傷組織 ，誘導分化出 芽及根 再生為 完整植株 ； 2 形成胚狀體，再產(chǎn)生植株； 細胞壁再生愈傷組織形成和植株再生 ? 植物育種中的 核質(zhì) 替換 ? 細胞 質(zhì)雜種 的獲得 ? 遠緣 雜交 創(chuàng)造新物種 ? 細胞器 的 互作 研究 三）、融合技術(shù)應用 第四節(jié) 植物轉(zhuǎn)基因技術(shù) 將目的基因插入到經(jīng)過改造的 TDNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌 的感染將目的基因穩(wěn)定的整合到植物的基因組中，并在子代中得到有效的表達，然后通過 細胞和組織培養(yǎng)技術(shù) 再生出轉(zhuǎn)基因植株 . ? 轉(zhuǎn)基因植物 （ Transgene plant） ? 利用植物遺傳工程進行 DNA重組 ， 將優(yōu)良的目的基因穩(wěn)定的整合到植物的基因組中 ， 并在子代中得到有效的表達 ， 獲得具有新的遺傳性狀的植物體 。 一 植物轉(zhuǎn)基因技術(shù) 1 生產(chǎn)抗體、重組疫苗和多肽類 藥物 藥用業(yè)價值的物質(zhì)， 多數(shù)正確折疊， 2 作為 生物反應器系統(tǒng) 大規(guī)模地生產(chǎn)各種蛋白質(zhì)和多肽等藥物， 促紅細胞生成素、表皮生長因子、生長激素、單克隆抗體、干擾素和疫苗用抗原蛋白。 轉(zhuǎn)基因植物應用 基因的獲得、 載體系統(tǒng)、 基因轉(zhuǎn)化、 基因的表達與分析 、 細胞和組織培養(yǎng) 再生出植株 。 二 植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)過程： 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 ? 基因轉(zhuǎn)化 將外源基因?qū)爰毎椒? ? 第一類：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù) ， 間接轉(zhuǎn)化 ? 利用農(nóng)桿菌的 Ti質(zhì)粒將外源基因轉(zhuǎn)入植物細胞 。 轉(zhuǎn)基因植物中約 80%是此轉(zhuǎn)化而來 ? 第二類：直接轉(zhuǎn)化技術(shù) 。 ? 基因槍法 、 電激法 、 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法 、 碳化硅纖維介導法和花粉管通道法等 。 三 基因?qū)爰夹g(shù) ? 農(nóng)桿菌在 VirD2蛋白幫助下 ， 選擇性 將 TDNA（ 轉(zhuǎn)移 DNA） （ 插入 Ti質(zhì)粒上兩個 25bp重復序列之間 ） 轉(zhuǎn)移到植物染色體 上 。 四 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng) 三個功能區(qū) 。 ① 轉(zhuǎn)移 DNA區(qū) （ TDNA區(qū) ） 。 ② 毒性區(qū) （ Vir區(qū) ） ③ 冠癭堿代謝基因的編碼區(qū) 。 天然的野生型 Ti質(zhì)粒 （ Vir區(qū)）， 25bp的重復序列 ? 構(gòu)建根癌農(nóng)桿根瘤菌 大腸桿菌穿梭質(zhì)粒 ? 篩選標記基因 啟動子 信號序列； 人工多克隆位點； 縮短載體長度 。 對野生型 Ti質(zhì)粒的改造： 1． 原生質(zhì)體受體系統(tǒng) 改變膜的通透性， 煙草、番茄、水稻、小麥和玉米等 250多種成功， ? 2． 愈傷組織受體系統(tǒng) 外植體 ， 愈傷組織， 易接受外源 DNA，遺傳穩(wěn)定性較差。 ? 3．種質(zhì)系統(tǒng) 生殖細胞如花粉粒、卵細胞為受體細胞，是單倍體細胞，成功率高 五受體系統(tǒng) 4． 胚狀體再生系統(tǒng) 最理想 ? 體細胞胚是 由具有卵細胞特性的胚性細胞發(fā)育而來 ，接受外源 DNA的能力強，繁殖效率高，可通過生物反應器進行大規(guī)模生產(chǎn)。 ? 5． 直接分化芽受體系統(tǒng) 由未分化的細胞直接分化形成 ，穩(wěn)定遺傳。操作簡單、周期短。轉(zhuǎn)化頻率最低 受體系統(tǒng) 1 基因水平的檢測 ， 限制性內(nèi)切酶分析 、 DNA序列分析 、 聚合酶鏈式反應 (PCR)、 Southern blot分析 、 Northern blot分析 、 原位雜交 六 轉(zhuǎn)入基因表達 分析 酶聯(lián)免疫吸附法 (ELISA) Western雜交 βD葡糖醛酸糖苷酶的組織化學定位分析 、 βD葡糖醛酸糖苷酶的熒光分析 、 βD葡糖醛酸糖苷酶的化學發(fā)光分析 熒光素酶分析 。 定量實時 PCR(quantitative realtime PCR)術(shù) 通過熒光報告物對 PCR反應對基因組中的某個單拷貝基因進行實時檢測轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù) 。 PCR產(chǎn)物量與起始模板量成正比 。 2 表達分析的方法
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