酵母雙雜交系統(tǒng)ppt課件-資料下載頁(yè)
2025-01-17 19:22本頁(yè)面
【正文】 CK2的關(guān)系 ? NSEP1是一種細(xì)胞周期特異的轉(zhuǎn)錄因子，還有 YB YBX1 、 CSDB、 DBPB 等別名 ? 與細(xì)胞增殖有關(guān)，具有調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯、 mRNA剪接及DNA修復(fù)等眾多功能 ? 通過(guò) γ干擾素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑 (Jak1/CK2/YB1途徑 )可激活 YB1核易位 ? NSEP1功能眾多，深入研究 CK2α′與 NSEP1之間的關(guān)系，對(duì)了解CK2在精子發(fā)生過(guò)程中的信號(hào)調(diào)節(jié)具有重要意義 泛素－ 52氨基酸融合蛋白的功能及其與蛋白激酶CK2的關(guān)系 ?泛素主要通過(guò) ATP 依賴性的泛素 蛋白水解酶復(fù)合體通路途徑高效并高度選擇性地對(duì)蛋白進(jìn)行完全或部分降解 ?這一途經(jīng)在細(xì)胞內(nèi)許多生理過(guò)程，例如細(xì)胞周期控制、細(xì)胞分化、應(yīng)激反應(yīng)、離子通道、 DNA的修復(fù)、細(xì)胞凋亡等過(guò)程中起著十分重要的作用 ?CK2是否通過(guò)這一途徑參與眾多的生物學(xué)功能還有待進(jìn)一步探討。 核糖體蛋白 L37a的功能及其與蛋白激酶 CK2的關(guān)系 ? 核糖體蛋白 L37a 是核糖體大亞基中一種重要的蛋白質(zhì)，具有如參與復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、 RNA加工、 DNA修復(fù)、正常細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化及發(fā)育調(diào)控等重要的核糖體外生理功能。 ? CK2與核糖體蛋白之間的關(guān)系也越來(lái)越成為一個(gè)具有吸引力的課題 ：已報(bào)道核糖體蛋白 L22， L5， L41與 CK2存在相互作用。本課題組黃功華等也篩選出泛素 /核糖體蛋白 S27a與 CK2α′亞基發(fā)生相互作用 NADH脫氫酶 4的功能及其與蛋白激 酶 CK2的關(guān)系 ? NADH脫氫酶是電子傳遞鏈中最重要的黃素蛋白，其基因的高表達(dá)可改變膜的通透性，可影響線粒體對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)。 ?本實(shí)驗(yàn)表明 NADH脫氫酶 4與 CK2α′之間存在相互作用，這與 CK2的物質(zhì)代謝功能還是與細(xì)胞凋亡的功能有關(guān)還有待進(jìn)一步研究。 篩選獲得的其它相互作用蛋白 CK2β亞基 17 211文庫(kù)質(zhì)粒上的插入片段經(jīng)序列同源分析，未找到已知蛋白 mRNA序列與之相對(duì)應(yīng)，它們的表達(dá)產(chǎn)物可能是新蛋白 第三部分 用 GSTpull down 進(jìn)一步證實(shí)蛋白質(zhì)間的相互作用 CK2α′ Experimental Control (GSTFusion) (GST) GST TP1 GST GST TP1 GST Wash SDSPAGE GST沉降示意圖 1 原理 CK2α′ CK2α′ 方法 融合表達(dá)質(zhì)粒 pGEX4T1TP1構(gòu)建與鑒定 2 材料與方法 材料 重組人蛋白激酶 CK2α′亞基 陳小文純化并鑒定 pACT2161質(zhì)粒和 pGEX4T1載體的雙酶切和定向重組 ★ 重組子轉(zhuǎn)化大腸桿菌 重組質(zhì)粒的篩選 重組質(zhì)粒的酶切鑒定及測(cè)序 GSTTP1融合蛋白的原核表達(dá) 重組的蛋白激酶 CK2α′亞基 體外表達(dá)獲得的 GSTTP1融合蛋白 加入到蛋白結(jié)合 緩沖液中室溫孵育 加入已平衡的谷胱甘肽－瓊脂糖珠，室溫孵育 蛋白結(jié)合緩沖液洗滌，除去非特異結(jié)合蛋白 SDSPAGE分析 GST融合蛋白沉降實(shí)驗(yàn) 3結(jié)果 Fig 7 The screening of rebinant human transition protein 1 transformants Clone 1~7,9~15 are positive clones 。 Clone 8 is a vector plasmid GSTTP1融合蛋白的原核表達(dá) Fig 9 SDSPAGE of the expressed rebinant human GSTTP1 in the transformed bacteria Lane 1: soluble fraction of lane 3。 Lane 2: precipitated fraction of lane 3； Lane 3: crude extract of IPTG induced bacteria transformed by pGEXGST TP1 。 Lane 4: crude extract of bacteria transformed by pGEXGST TP1 that wasn’t induced by IPTG。 M: protein molecular weight standard GST 融合蛋白沉降實(shí)驗(yàn)結(jié)果 CK2α′ GSTTP1 GST Fig 10 GST pull down assay M: protein molecular weight standard Lane 1: GST Lane 2: GSTTP1+ CK2α′ Lane 3: CK2α＇ 4討論 ? GSTpull down實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞外直接檢驗(yàn)蛋白質(zhì)分子間相互作用 ?細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外實(shí)驗(yàn)都證實(shí) TP1與 CK2α′亞基有相互作用 蛋白激酶 CK2可能與精子細(xì)胞變態(tài)有關(guān) ?本研究有待于進(jìn)一步研究的方向： ? 用免疫共沉淀、細(xì)胞內(nèi)共定位分析等方法進(jìn) 一步確定上述經(jīng)酵母雙雜交篩選出的相互作 用蛋白 ? 通過(guò)對(duì)相互作用蛋白的原核表達(dá)及其純化并通過(guò) 激酶反應(yīng)等來(lái)確定其是否為 CK2的磷酸化底物 ? 研究 CK2α′與 TP1之間的功能關(guān)系，進(jìn)一步 闡明在精子發(fā)生中的作用機(jī)制及其意義 小結(jié) ? 經(jīng)人睪丸 cDNA文庫(kù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)的 AH109 （ pGBKT7HCKα′）細(xì)胞，初步篩選獲得 138 個(gè)陽(yáng)性候選克隆 ? 經(jīng)進(jìn)一步確證和分組，從 1~24號(hào)陽(yáng)性候選克隆 中篩選出 8種與蛋白激酶 CK2α′相互作用蛋白 ? 成功地將 8種在大腸桿菌分離得到的文庫(kù)質(zhì)粒 單獨(dú)轉(zhuǎn)化 AH109，并排除了文庫(kù)質(zhì)粒本身對(duì) AH109菌株的自主激活活性 ? 將上述 8種文庫(kù)質(zhì)粒與 BD質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化 AH109以 實(shí)現(xiàn)一對(duì)一回復(fù)性雜交，最后證實(shí)都表現(xiàn)出有 相互作用 ?成功測(cè)出 8種相互作用蛋白插入片段的 cDNA序 列，并確定了其名稱。 ?細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外實(shí)驗(yàn)都證實(shí)蛋白激酶 CK2α′ 與人轉(zhuǎn)換蛋白 TP1之間有相互作用
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