【正文】 和第四個堿基之間產(chǎn)生缺口，并形成單鏈 TDNA。 ? TDNA的 LB和 RB在整合中的作用是不對稱的， RB順序與整合有關(guān)，而 LB無關(guān)。 ? TDNA的整合可以是單拷貝的，也可以是多拷貝的，成串聯(lián)形式排列，但整合位點的特異性尚未確定。 植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的共整合系統(tǒng) ? TDNA克隆在大腸桿菌質(zhì)粒上，含有 選擇標(biāo)記和植物選擇標(biāo)記 Kmr。 ? 首先在 組分子，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中，質(zhì)粒與 Ti質(zhì)粒上的同源序列發(fā)生同源重組，將外源基因整合到 Ti質(zhì)粒上，用于侵染植物細(xì)胞。TDNA重組分子整合到植物細(xì)胞染色體 DNA上， Kmr篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞。 植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的雙元系統(tǒng) ? 目前 TDNA轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)方法是雙元系統(tǒng)，即穿梭質(zhì)粒。插入外源基因的重組穿梭質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)化含有 Ti質(zhì)粒的根瘤農(nóng)桿菌，經(jīng)篩選后直接感染植物細(xì)胞。與共整合系統(tǒng)所不同的是，含外源基因的質(zhì)?？稍谵r(nóng)桿菌內(nèi)自主復(fù)制并保留下來。農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞后，植物的創(chuàng)傷信號啟動 Ti質(zhì)粒上的 Vir基因，隨后將穿梭質(zhì)粒的 TDNA切割下來，轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中。 典型的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng) ? 典型的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是利用大腸桿菌中位點特異的轉(zhuǎn)座或昆蟲細(xì)胞中的同源重組來產(chǎn)生重組桿狀病毒。這些過程要求大量的操作時間，周期長達(dá)幾周。 BaculoDirect? 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)簡化了這些過程，節(jié)省了大量時間，使你可以比以往任何時候更快地獲得桿狀病毒表達(dá)結(jié)果。 ? BaculoDirect? 系統(tǒng)利用快速、簡便的Gateway174。技術(shù)。BaculoDirect? 線性DNA包含了 attR位點，允許與包含有目的基因的 Gateway174。入門克隆進(jìn)行有效的重組。將entry克隆、BaculoDirect? 線性DNA和 Gateway174。 LR Clonase? 酶混合物稍加混勻，在室溫下反應(yīng) 1小時即可。最終的反應(yīng)混和物中包含有攜帶目的基因的桿狀病毒，可以直接用于轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞（ sf9或 sf21）。 SV40病毒作為載體 反轉(zhuǎn)錄病毒 ? 反轉(zhuǎn)錄病毒載體是常用的病毒載體之一。 ? 反轉(zhuǎn)錄病毒的 DNA基因組的兩端各有一個長末端重復(fù)序列 (5‘— LTR和 3’— LTR)，有一個包裝病毒顆粒時必需的非編碼序列 ψ+，同時有三個編碼蛋白質(zhì)的基因 gag、 pol和 env。 ? 反轉(zhuǎn)錄病毒載體可以容納外源 DNA的長度在 10 kb左右，以很高的轉(zhuǎn)染率感染宿主細(xì)胞，特別是分裂中的細(xì)胞。轉(zhuǎn)入宿主的細(xì)胞后，反轉(zhuǎn)錄病毒載體隨即整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi)，這種整合的位點是隨機(jī)的。 ? 反轉(zhuǎn)錄病毒載體在構(gòu)建時，刪去了 poi、 env基因和 gag基因的 3’端，但保留了病毒顆粒所需的 ψ+序列。其目的是在于提高載體的安全性，防止反轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞后進(jìn)行增殖并包裝成病毒顆粒對宿主細(xì)胞造成可能的傷害。這樣，在制備反轉(zhuǎn)錄病毒載體時，就必須有一個輔助細(xì)胞系，這種細(xì)胞內(nèi)有缺陷型病毒可以提供包裝用的外殼蛋白，但自身沒有包裝信號。這樣，反轉(zhuǎn)錄病毒載體就可利用這些外殼蛋白包裝成病毒顆粒在輔助細(xì)胞系內(nèi)大量擴(kuò)增。 ? 反轉(zhuǎn)錄病載體多半用于基因治療，由于病毒載體在宿主細(xì)胞基因組上隨機(jī)插入，人們擔(dān)心會引起不安全的后果，這種載體還在不斷改進(jìn)之中。 YAC 人工染色體載體 ? 是利用釀酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae）的染色體的復(fù)制元件構(gòu)建的載體，其工作環(huán)境也是在釀酒酵母中。 ? 釀酒酵母的形態(tài)為扁圓形和卵形，生長的代時為 90 分鐘；含 16 條染色體，其大小為 2251900kb ，總計有14 106 bp；具真核 mRNA 的加工活性。 人造染色體載體 酵母人造染色體（ Yeast Artificial Chromosomes YAC） YAC載體應(yīng)含有下列元件： 酵母染色體的端粒序列 酵母人造染色體的構(gòu)建： pYAC4 CEN4 EcoRI URA3 TEL BamHI TEL ori Apr TRP1 ARS1 酵母染色體的復(fù)制子 酵母染色體的中心粒序列 酵母系統(tǒng)的 選擇標(biāo)記 大腸桿菌的復(fù)制子 大腸桿菌的 選擇標(biāo)記 YAC載體的裝載量為 350 400 kb 人造染色體載體 酵母人造染色體（ Yeast Artificial Chromosomes YAC） 酵母人造染色體的使用： pYAC4 CEN EcoRI URA TEL BamHI TEL ori Apr TRP ARS EcoRI EcoRI EcoRI BamHI 連接 轉(zhuǎn)化酵母菌 重組酵母染色體 ? pYAC4 ：當(dāng)用 BamHⅠ 切割成線狀后，就形成了一個微型酵母染色體，包含染色體復(fù)制的必要順式元件，如自主復(fù)制序列、著絲粒和位于兩端的端粒。這些元件在酵母菌中可以驅(qū)動染色體的復(fù)制和分配，從而決定這個微型染色體可以攜帶酵母染色體大小的 DNA 片段。 ? YAC 載體的原理性工作流程：對于 BamHⅠ 切割后形成的微型酵母染色體，當(dāng)用 EcoRⅠ 或 SmaⅠ 切割抑制基因 sup4 內(nèi)部的位點后形成染色體的兩條臂，與外源大片段 DNA 在該切點相連就形成一個大型人工酵母染色體，通過轉(zhuǎn)化進(jìn)入到酵母菌后可象染色體一樣復(fù)制，并隨細(xì)胞分裂分配到子細(xì)胞中去，達(dá)到克隆大片段DNA 的目的。裝載了外源 DNA 片段的重組子導(dǎo)致抑制基因 sup4 插入失活，從而形成紅色菌落； 而載體自身連接后轉(zhuǎn)入到酵母細(xì)胞后形成白色菌落。這些紅色的裝載了不同外源 DNA 片段的重組酵母菌菌落的群體就構(gòu)成了 YAC 文庫。 YAC 文庫裝載的 DNA 片段的大小一般可達(dá) 200500kb，有的可達(dá) 1Mb 以上，甚至達(dá)到 2Mb 。 用于轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因 用于酵母菌轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因主要有 營養(yǎng)缺陷型互補基因 和 顯性基因 兩大類 營養(yǎng)缺陷型互補基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如： LEU、 TRP、 HIS、 LYS、 URA、 ADE 但對于多倍體酵母來說，篩選營養(yǎng)缺陷型的受體非常困難 營養(yǎng)缺陷型的互補基因 用于轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因 顯性標(biāo)記基因的編碼產(chǎn)物只要是毒性物質(zhì)的抗性蛋白 顯性標(biāo)記基因 aph 氨基糖苷轉(zhuǎn)移酶 抗 G418 cat 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶 抗氯霉素 dhfr 二氫葉酸還原酶 抗氨甲喋呤和磺胺 cup1 銅離子螯合物 耐受銅離子 suc2 蔗糖轉(zhuǎn)化酶 耐受高濃度蔗糖 ilv2 乙酰乳糖合成酶 抗硫酰脲除草劑 標(biāo)記基因 編碼產(chǎn)物 遺傳表型 C 用于基因轉(zhuǎn)移的受體菌或細(xì)胞 3 基因工程的基本條件 各種基因工程受體的特性 實驗室常用的基因工程受體 受體細(xì)胞應(yīng)具備的條件 受體細(xì)胞應(yīng)具備的條件 限制性缺陷型 外切酶和內(nèi)切酶活性缺陷（ recB， recC， hsdR） 重組整合缺陷型 用于基因擴(kuò)增或高效表達(dá)的受體細(xì)胞 （ recA） 具有較高的轉(zhuǎn)化效率 具有與載體選擇標(biāo)記互補的表型 感染寄生缺陷型 防止重組細(xì)菌擴(kuò)散污染，生物武器除外 各種基因工程受體的特性 大腸桿菌 遺傳背景清楚，載體受體系統(tǒng)完備，生長迅速，培養(yǎng)簡單，重組子穩(wěn)定 適用于外源 DNA的擴(kuò)增和克隆、原核生物基因的高效表達(dá)、基因文庫的構(gòu)建，是 DNA重組實驗和基因工程的主要受體菌 產(chǎn)結(jié)構(gòu)復(fù)雜、種類繁多的內(nèi)毒素 各種基因工程受體的特性 枯草桿菌 遺傳背景清楚，蛋白質(zhì)分泌機(jī)制健全 ，生長迅速，培養(yǎng)簡單，不產(chǎn)內(nèi)毒素 適用于原核生物基因的克隆、表達(dá)以及重組蛋白多肽的有效分泌 遺傳欠穩(wěn)定，載體受體系統(tǒng)欠完備 各種基因工程受體的特性 鏈霉菌 抗生素的主要生產(chǎn)者，分子遺傳相對操作簡便，不產(chǎn)內(nèi)毒素 主要用于抗生素生產(chǎn)菌株的改良 遺傳不穩(wěn)定，生長相對緩慢 各種基因工程受體的特性 酵母菌 具有真核生物的特征，遺傳背景清楚，生長迅速，培養(yǎng)簡單，外源基因表達(dá)系統(tǒng)完善，遺傳穩(wěn)定 適用于外源 DNA的擴(kuò)增、克隆以及真核生物基因的高效表達(dá)、基因文庫的構(gòu)建、真核生物基因表達(dá)調(diào)控的研究，是 DNA重組實驗和基因工程重要的真核性受體菌 內(nèi)源性蛋白產(chǎn)物種類繁多且含量高 各種基因工程受體的特性 昆蟲細(xì)胞（家蠶） 具有真核生物的特征，外源基因表達(dá)量高，繁殖相對較快，培養(yǎng)成本低廉，遺傳穩(wěn)定 適用于真核生物基因的高效表達(dá) DNA重組操作系統(tǒng)欠完善 各種基因工程受體的特性 哺乳動物細(xì)胞（中國 倉鼠卵巢細(xì)胞 CHO） 與人的親緣關(guān)系近，分子重組表達(dá)系統(tǒng)健全，具有合適的糖基化修飾系統(tǒng) 適用于哺乳類動物和人的基因表達(dá)調(diào)控研究、基因藥物的生產(chǎn)，是 DNA重組實驗和基因工程的主要哺乳動物受體 細(xì)胞培養(yǎng)條件苛刻，生長緩慢 各種基因工程受體的特性 植物細(xì)胞（擬南芥菜、煙葉 ） 農(nóng)作物的經(jīng)濟(jì)意義重大，轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞易于分化，細(xì)胞培養(yǎng)簡單且成本低廉，具有光合作用 適用于高等植物基因表達(dá)調(diào)控的研究、基因藥物的生產(chǎn)，農(nóng)作物品質(zhì)的改良 遺傳操作繁瑣 實驗室常用的基因工程受體 大腸桿菌 用于接受質(zhì)粒： C600、 W31 HB10 JM8 JM101（ Aps、 Tcs、 Cms） 用于接受 lDNA： LE39 ED8654 酵母菌 哺乳動物細(xì)胞 CHO 畢赤酵母 啤酒酵母