【正文】 胞經(jīng)融合后，不通過減數(shù)分裂而導(dǎo)致低頻率的基因重組。 基因重組 二、轉(zhuǎn)化（ transformation） ? 受體細胞直接吸收來自供體細胞的 DNA片段，并把它整合到自己的基因組中，從而獲得了供體細胞的部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后的受體菌，稱為轉(zhuǎn)化子。供體菌的 DNA片段稱為轉(zhuǎn)化因子。 ? 只有處于感受態(tài)的細胞才能接受轉(zhuǎn)化因子，進行轉(zhuǎn)化作用。 感受態(tài)細胞是能吸收外來的 DNA片斷，并能把它整合到自己的染色體上以實現(xiàn)轉(zhuǎn)化的細胞。 ? 轉(zhuǎn)化現(xiàn)象是在 1928年由 Griffith進行肺炎雙球菌的研究中發(fā)現(xiàn)的。 ? 受體菌直接接受供體菌的 DNA片段而獲得部分新的遺傳性狀的現(xiàn)象，就稱為轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)化作用。 基因重組 二、轉(zhuǎn)化 ? 轉(zhuǎn)化過程： 感受態(tài)細胞的出現(xiàn) DNA的吸附 DNA進入細胞 DNA解鏈，形成受體 DNA－供體 DNA復(fù)合物 DNA復(fù)制分離 基因重組 三、轉(zhuǎn)導(dǎo)（ transfection） ? 轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象由 ， 以后又在許多原核微生物中陸續(xù)發(fā)現(xiàn) 。 ? 通過溫和噬菌體的媒介 ， 把供體細胞的小片段 DNA攜帶到受體細胞中 ，通過交換與整合 ， 使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象 ， 稱為轉(zhuǎn)導(dǎo) 。 由轉(zhuǎn)導(dǎo)作用而獲得部分新遺傳性狀的重組細胞 ， 稱為 轉(zhuǎn)導(dǎo)子 。 基因重組 三、轉(zhuǎn)導(dǎo)（ transfection） ? 普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo) 由缺陷型噬菌體誤包 （ 而非整合 ） 供體細菌 DNA中的任何一部分片段 （ 包括核外遺傳物質(zhì)在內(nèi) ） 后 ， 當(dāng)它再次感染受體細菌時 ， 使后者獲得了這部分遺傳性狀的現(xiàn)象 ， 稱為普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo) 。 它的轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率為 10－ 5～ 10－ 8。 基因重組 三、轉(zhuǎn)導(dǎo)（ transfection） ? 局限性轉(zhuǎn)導(dǎo) 由溫和噬菌體侵染而形成的某一溶源細菌群被誘導(dǎo)裂解時 ， 其中極少數(shù)個體的 DNA可能與噬菌體 DNA 發(fā)生若干特定基因的交換 ， 從而被整合到噬菌體的基因組上 ， 當(dāng)該噬菌體再次感染受體細菌時 ， 就使受體細菌獲得了這一特定遺傳性狀的現(xiàn)象 ，稱為局限性轉(zhuǎn)導(dǎo) ， 它的轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率為 106。 溶源轉(zhuǎn)變 ? 溶源轉(zhuǎn)變 (lysogenic conversion)：是一種與轉(zhuǎn)導(dǎo)相似，但本質(zhì)上卻不相同的特殊現(xiàn)象，即當(dāng)溫和噬菌體感染其宿主后，發(fā)生溶源化，因噬菌體的基因整合到宿主的核基因組上，而使后者獲得除免疫性以外的新性狀的現(xiàn)象，稱為溶源轉(zhuǎn)變。 ? 當(dāng)宿主喪失這一噬菌體時，通過溶源轉(zhuǎn)變而獲得的性狀也同時消失。 ? 溶源轉(zhuǎn)變與轉(zhuǎn)導(dǎo)有本質(zhì)上的不同，首先是它的溫和噬菌體不攜帶任何供體菌的基因；其次，這種噬菌體是完整的，而不是缺陷的。 原生質(zhì)體融合 (protoplast fusion) ?通過人為的方法，使遺傳性狀不同的兩細胞的原生質(zhì)體發(fā)生融合，并進而發(fā)生遺傳重組以產(chǎn)生同時帶有雙親性狀的、遺傳穩(wěn)定的融合子 (fusant)的過程，稱為原生質(zhì)體融合。 突變體的檢測與篩選 一 、 突變體的檢測 ?直接檢測表現(xiàn)型 菌落 、 影印平板法等 ?間接檢測法 通過控制培養(yǎng)條件獲得 ， 如 Ames試驗 。 影印平板技術(shù) 突變體的檢測與篩選 二 、 突變體的篩選 ?為什么進行突變體的篩選 ？ ? 誘變處理使微生物群體中出現(xiàn)各種突變型 ， 其中絕大多數(shù)是 負變株 。 要獲得預(yù)定的效應(yīng)表型主要靠科學(xué)的篩選方案和篩選方法 。 ?有效技術(shù)是創(chuàng)造一種只允許突變體生長 ， 抑制原養(yǎng)型菌生長的培養(yǎng)基或生長環(huán)境條件 。 分子遺傳學(xué)新技術(shù)在環(huán)境工程與環(huán)境保護中的應(yīng)用 遺傳工程是從分子遺傳學(xué) ,特別是從細菌質(zhì)粒和限制性酶等研究中發(fā)展起來的一個分子遺傳學(xué)的分支學(xué)科 。 它綜合采用了生物化學(xué)和微生物學(xué)的現(xiàn)代技術(shù)和手段 ,尤其是酶學(xué)的方法 ,將某種生物的基因 (DNA片段 )轉(zhuǎn)移到另一生物的細胞中去 ,通過其復(fù)制以及表達 ,使該生物獲得新的遺傳性狀 。 ? 遺傳工程可分為狹義和廣義兩種 。 狹義的遺傳工程即指基因工程 ,廣義的遺傳工程還包括細胞工程 ,染色體工程 ,細胞器工程等 。 習(xí)慣上所說的遺傳工程多指基因工程 。 ? 基因工程又稱重組 DNA技術(shù) ,就是在體外對不同來源的 DNA分子進行重組 ,將此重組 DNA引入合適的寄主細胞內(nèi) ,并使之復(fù)制和表達 。 質(zhì)粒育種 質(zhì)粒：染色體外 DNA，游離于原核生物染色體外 ,具有獨立復(fù)制能力的小型共價閉合環(huán)狀 DNA分子，在細胞分裂過程中能復(fù)制將遺傳性狀傳給后代。 ? 質(zhì)粒上攜帶著某些染色體上所沒有的基因 ,使細菌等原核生物被賦予了某些對其生存可有可無的特殊功能。 ? 外界因素可使質(zhì)粒發(fā)生丟失或轉(zhuǎn)移，喪失由該質(zhì)粒決定的某些性狀，但菌體不死亡。 ? 質(zhì)?？烧T導(dǎo)產(chǎn)生。 ? 質(zhì)粒有重組功能。 分子遺傳學(xué)新技術(shù)在環(huán)境工程與環(huán)境保護中的應(yīng)用 質(zhì)粒是一種復(fù)制子 ?嚴(yán)緊型復(fù)制控制：與核染色體復(fù)制同步 ?松弛型復(fù)制控制：與核染色體復(fù)制不同步 發(fā)現(xiàn)的質(zhì)?；颍? ? F因子：致育因子或性因子，大腸桿菌等細菌中決定性別的質(zhì)粒。 ? R因子：對多種抗生素表現(xiàn)抗性 ? Col因子：控制大腸桿菌素產(chǎn)生 ? 降解性質(zhì)粒：假單胞菌中發(fā)現(xiàn)，可編碼一系列可降解能降解復(fù)雜物質(zhì)的酶，從而能利用細菌難以利用的物質(zhì)做 C源。 分子遺傳學(xué)新技術(shù)在環(huán)境工程與環(huán)境保護中的應(yīng)用 質(zhì)粒育種 將兩種或多種微生物通過細胞結(jié)合或融合技術(shù)，使供體菌的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到受體菌內(nèi)，使受體菌保留自身功能質(zhì)粒，同時獲得供體菌的功能質(zhì)粒，即培育出具有兩種功能質(zhì)粒的新品種。 分子遺傳學(xué)新技術(shù)在環(huán)境工程與環(huán)境保護中的應(yīng)用 基因工程特點 ? 打破了物種的界限，突破了親緣關(guān)系的限制。 ? 可進行定向變異與育種。 ? 可創(chuàng)造自然界原來沒有的生物。 分子遺傳學(xué)新技術(shù)在環(huán)境工程與環(huán)境保護中的應(yīng)用 基因工程的操作 ? 從供體細胞中選取帶有目的基因的 DNA片斷； ? 目的 DNA的片斷和質(zhì)粒在體外重組； ? 將重組體轉(zhuǎn)入受體細胞； ? 重組體克隆的篩選與鑒定； ? 外源基因表達產(chǎn)物的分離與提純。 分子遺傳學(xué)新技術(shù)在環(huán)境工程與環(huán)境保護中的應(yīng)用 目的基因的取得 途徑有 3種： ? 選擇適宜的供體細胞，以便從中采集分離到有生產(chǎn)意義的目的基因； ? 通過逆轉(zhuǎn)錄酶的作用由 mRNA合成 cDNA(互補 DNA)； ? 用化學(xué)方法合成特定功能的基因。 分子遺傳學(xué)新技術(shù)在環(huán)境工程與環(huán)境保護中的應(yīng)用 載體 載體必須具備下列幾個條件： ? 是一個有自我復(fù)制能力的復(fù)制子，松弛型復(fù)制； ? 抗生素抗性選擇； ? 能在受體細胞內(nèi)大量增殖，有較高的復(fù)制率； ? 載體上最好只有一個限制性內(nèi)切核酸酶的切口，使目的基因能固定地整合到載體 DNA的一定位置上； ? 載體上必須有一種選擇性遺傳標(biāo)記，賦予宿主細胞易于檢測的表型。 目前原核受體細胞的載體主要有細菌質(zhì)粒 (松弛型 )和 λ 噬菌體兩類。真核細胞受體的載體主要有 SV40病毒（動物）和 Ti質(zhì)粒（植物）。 分子遺傳學(xué)新技術(shù)在環(huán)境工程與環(huán)境保護中的應(yīng)用 目的基因與載體 DNA的體外重組 對目的基因與載體 DNA均采用限制性內(nèi)切酶處理 ， 從而獲得互補粘性末端或人工合成粘性末端 。 然后把兩者放在較低的溫度 (5～ 6℃ )下混合 “ 退火 ” 。 由于每一種限制性內(nèi)切酶所切斷的雙鏈 DNA片段的粘性末端有相同的核苷酸組分 ， 所以當(dāng)兩者相混時 ， 凡粘性末端上堿基互補的片段 ， 就會因氫鍵的作用而彼此吸引 ， 重新形成雙鏈 。 這時 ， 在外加連接酶的作用下 ， 供體的 DNA片段與質(zhì)粒 DNA片段的裂口處被 “ 縫合 ” ，形成一個完整的有復(fù)制能力的環(huán)狀重組體 。 分子遺傳學(xué)新技術(shù)在環(huán)境工程與環(huán)境保護中的應(yīng)用 重組載體引入受體細胞 體外反應(yīng)生成的重組載體只有將其引入受體細胞后 ， 才能使其基因擴增和表達 。 受體細胞可以是微生物細胞 ， 也可以是動物或植物細胞 。 把重組載體 DNA分子引入受體細胞的方法很多 。 若以重組質(zhì)粒作為載體時 ， 可以用轉(zhuǎn)化的手段；若以病毒 DNA作為重組載體時 ， 則用感染的方法 。 分子遺傳學(xué)新技術(shù)在環(huán)境工程與環(huán)境保護中的應(yīng)用 PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）技術(shù) 在 1983年，美國 Cetus公司 人類遺傳研究室的科學(xué)家 .發(fā)明的。 PCR是一種在體外快速擴增特定基因或 DNA序列的方法，有稱之為體外擴增法。 分子遺傳學(xué)新技術(shù)在環(huán)境工程與環(huán)境保護中的應(yīng)用 (c) (b) 引物 2 5’ 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ (d) 新引物 5’ 3’ 靶 DNA的擴增 (a) 5’ 3’ 引物 1 3’ 5’ 3’ 5’ 引物 2互補鏈 引物 1互補鏈 單位長度的鏈 不同長度的鏈 5’ 3’ 3’ 5’ 引物 1互補鏈 引物 2互補鏈 目的片段（不同長度的鏈未示出） 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)示意圖 (e) (f) (g) 分子遺傳學(xué)新技術(shù)在環(huán)境工程與環(huán)境保護中的應(yīng)用 PCR操作步驟