【正文】 桿菌培養(yǎng)溫度為 37℃，酵母菌培養(yǎng)溫度為 32℃， PH 值為 ，通氣量為 0 了 20L/min，27L/min、 40L/min、 54L/min、 60L/min、 80L/min。研究表明：芽孢桿菌和酵母菌的菌體產(chǎn)量，隨著通氣量的增加而增加，而乳酸桿菌的菌體產(chǎn)量，隨著通氣量的增加而緩慢減少。原因是芽孢桿菌和酵母菌是好氧性菌，而乳酸桿菌是兼性菌，以厭氧呼吸為主。因此，在工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用上 ，要求在發(fā)酵過程中設(shè)兩個階段，第一個反應(yīng)階段（發(fā)酵前 2427 小時），通氣時間長，停氣時間短。（通氣 3 小時，停氣 1 小時，通氣量為 60L/min）。第二個反應(yīng)階段（發(fā)酵后 2427 小時），通氣時間短，停氣時間長（通氣 1 小時，停氣 3 小時，通氣量為 20L/min）。發(fā)酵前階段適合酵母菌和芽孢桿菌快速生長，后階段適合乳酸桿菌快速生長。 （五）、培養(yǎng)基碳素營養(yǎng)與菌體產(chǎn)量的關(guān)系。 本研究采用葡萄糖、蔗糖、大豆粉、玉米分、土豆粉、麥麩六種物質(zhì)作為培養(yǎng)菌種的培養(yǎng)基碳源，研究其與菌體產(chǎn)量的關(guān)系，結(jié)果表明：對乳酸桿菌、芽孢桿菌 、酵母菌三種微生物生長作用最好的碳源是葡萄糖。除了葡萄糖以外，能使乳酸桿菌快速生長的碳源還有蔗糖和土豆淀粉。而對芽孢桿菌來講，除了葡萄糖以外，沒有作用效果特別明顯的葡萄糖替代品。酵母菌的碳源，除了作用最佳的葡萄糖以外，蔗糖和大豆粉作用效果較好。發(fā)酵培養(yǎng)不同的菌種，對碳源的濃度要求各有差異，但差異不明顯。結(jié)果表明，混合發(fā)酵時，葡萄糖的含量以 2%最佳。工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用中，可以用土豆粉和大豆粉替代葡萄糖作為碳源，以濃度 %效果最佳。 （六）、培養(yǎng)基氮素營養(yǎng)與菌體產(chǎn)量的關(guān)系。 本研究采用上述植物油、蛋白胨、大豆粉、 玉米粉、土豆粉、麥麩六種物質(zhì)作為培養(yǎng)菌種的培養(yǎng)基氮源研究其與菌體產(chǎn)量的關(guān)系，結(jié)果表明：上敘所有氮源的效果都不如蛋白胨。對乳酸桿菌來言，最好的氮源是蛋白胨，除此以外，其他氮源的效果明顯較差。原因是乳酸桿菌類微生物一般沒有蛋白酶，不能分解蛋白質(zhì)，氮源只能利用蛋白肽類物質(zhì)。因此，在工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用中，最好加入蛋白胨作為乳酸桿菌的氮源，以縮短“延遲期”的時間。對芽孢桿菌和酵母菌而言，除了蛋白胨可以作為氮源以外，植物油、大豆粉、玉米粉等也有一定的作用效果。本研究結(jié)果顯示，在混合發(fā)酵過程中，蛋白胨的最佳用量為 %，植物 油的最佳用量為 %。因大豆粉、玉米粉、土豆粉、麥麩四樣物質(zhì)，在作為培養(yǎng)基 30 時，既可以提供氮源，又可提供碳源，因此，最佳使用量以作為碳源的 6%為準(zhǔn)。 五、非營養(yǎng)性物質(zhì)與益生菌菌體產(chǎn)量的關(guān)系 本研究選取了低聚木糖、低聚果糖、低聚甘露糖三種寡糖，以及土霉素、金霉素、桿菌肽鋅三種常用的抗生素來研究這些非營養(yǎng)性物質(zhì)對益生菌的作用。低聚果糖和低聚木糖由山東龍力生物科技有限公司提供，低聚甘露糖由美國奧特奇公司提供。試驗(yàn)采用的乳酸桿菌培養(yǎng)基為 MRS 培養(yǎng)基，芽孢桿菌培養(yǎng)基為 BPY 培養(yǎng)基。酵母菌采用麥芽汁培養(yǎng)基。培養(yǎng)時間均為 48h，乳酸桿菌和芽孢桿菌的培養(yǎng)溫度為 37℃，酵母菌的培養(yǎng)溫度為 32℃，培養(yǎng)初始 PH 值均為 ，酵母菌和芽孢桿菌采用好氣性培養(yǎng)，乳酸桿菌采用厭氧培育。低聚糖的濃度設(shè) %～ %六處理，抗生素的濃度設(shè) 1 單位 /g10 單位 /g 十個處理，研究結(jié)果如下： （一）、低聚糖的種類與菌體產(chǎn)量的關(guān)系。 本研究中采用低聚木糖、低聚果糖、低聚甘露糖三種寡糖研究低聚糖與乳酸桿菌、芽孢桿菌、酵母菌的生長關(guān)系。研究表明，三種低聚糖無論是哪一種，都對乳酸桿菌具有特別明顯的促進(jìn)作用，作用效果最好的是低聚果糖，但三種寡糖的作用效 果比較，沒有顯著差異。而三種低聚糖對芽孢桿菌和酵母菌的生長促進(jìn)作用不大，與空白對照比較，沒有明顯差異。 （二）、低聚糖的濃度對乳酸菌的影響。 本研究中采用低聚木糖、低聚果糖、低聚甘露糖三種寡糖（濃度分別為 %、 %、%、 %、 %、 %）研究低聚糖濃度作用效果的影響，結(jié)果表明：對乳酸桿作用效果最好的是低聚果糖，但濃度要求較高，在 %左右達(dá)到最佳效果；作用達(dá)到最佳效果所需要濃度最低的是低聚木糖，在 %時，即達(dá)到最佳作用效果，隨著濃度的增加，作用效果反而降低。研究結(jié)果 表明，在微生態(tài)制劑中，添加低聚糖時，低聚木糖是首選的寡糖品種，用量少、作用效果也明顯。 （三）、抗生素與菌體產(chǎn)量的關(guān)系。 本研究中采用了土霉素、金霉素、桿菌肽鋅三種常用的抗生素研究其對活菌制劑中三種微生物的影響。結(jié)果表明：無論是土霉素、金霉素還是桿菌肽鋅，都對乳酸桿菌、芽孢桿菌和酵母菌的生長有抑制作用，只是抑制作用的程度不同而已。抑制作用最大的是金霉素和土霉素，桿菌肽鋅對三種菌體的抑制作用較小。抗生素對三種菌的抑制能力隨著濃度（ 1～ 10 單位 /g）的增加而增強(qiáng)。研究結(jié)果，探索抗生素與活菌劑的伍配使用，土霉素和金霉素是不成功的，桿菌肽鋅還能與與活菌劑伍配，但還需要進(jìn)一步研究。 31 六、 NBM 微生態(tài)制劑的研制 （一）、菌制劑菌種的種類與數(shù)量 在本研究所制取的產(chǎn)品中，采用了三個菌種，一是本研究自行分離選育的乳酸菌 —LS9，二是從中國科學(xué)院微生物研究所菌種保存中心引入的枯草芽孢桿菌 — ，三是產(chǎn)朊假絲酵母菌 — （來源與芽孢桿菌相同） 菌種數(shù)量：乳酸桿菌 108 個 /ml，枯草芽孢桿菌 108 個 /ml，產(chǎn)朊假絲酵母菌 108 個 /ml，有效活菌數(shù) 108 個 /ml。 （二）、活菌制劑的培 養(yǎng)基配方 研究結(jié)果表明：培養(yǎng)乳酸桿菌、芽孢桿菌和酵母菌的最好碳源是葡萄糖。在生產(chǎn)應(yīng)用中，葡萄糖的替代物，對乳酸菌而言是土豆粉，對酵母菌而言是大豆粉。培養(yǎng)上述三種菌的最好氮源是蛋白胨，生產(chǎn)應(yīng)用中的替代物是植物油。為了縮短生產(chǎn)發(fā)酵過程中菌種的延遲期，需適量添加蛋白胨和葡萄糖。而針對不同的用途，選擇不同的主體菌種，進(jìn)而選擇不同的碳源和氮源。 豬用活菌制劑，主體菌種是乳酸菌，主體碳源是土豆粉。反芻動物和禽類用的活菌制劑，主體菌種是酵母菌，主體碳源是大豆粉。經(jīng)篩選項(xiàng)，其優(yōu)化配方為： 主體碳源 6%+葡萄糖 2%+蛋白胨 %+植物油 %+%、 %、CaCO31%、 %、 %。 （三）、低聚糖的種類和比例： 低聚糖的種類是低聚木糖，其比例為 %。 （四）、 卵黃免疫球蛋白（ IgY）的比例： %，在制劑中的有效含量為 320 滴度 /g。 （五）、 蠅蛆蛋白粉比例： 1%，其有效成份為蠅蛆抗菌肽。 綜上所述， NBM 制劑的配方如下： 活菌劑 %+低聚糖 %+卵黃免疫球蛋白 %+蠅蛆蛋白粉 1%。 七、 NBM 制劑穩(wěn)定性研究 （一） NBM 制劑微膠囊包埋材 料的選擇。 本研究選擇阿拉伯膠、變性淀粉、海藻酸鈉、瓊脂、麥芽糊精和玉米糖漿作為 NBM制劑的微膠囊包埋壁材，對其進(jìn)行了微膠囊包埋對比試驗(yàn)，結(jié)果表明：海藻酸鈉 5%+變性淀粉 35%+阿拉伯膠 15%+麥芽糊精 25%+玉米糧漿 20%作為微膠囊包埋壁材，效果最佳，包埋率高達(dá) 97%以上。芯材原料（微生態(tài)制劑）與混合壁材的比為 1： 1?；旌途鶆蚝?，通過噴霧干燥制成成品。在研究過程中發(fā)現(xiàn)， 2%的氯化鈣溶液有利于膠囊的形成和菌種包埋率的保持。 32 （二） NBM 制劑微膠囊包埋產(chǎn)品的熱穩(wěn)定性 本研究將制成的微膠囊包埋產(chǎn)品，通過 70℃的 高溫?zé)崽幚?10min 后研究其穩(wěn)定性，結(jié)果表明，活菌的成活率高達(dá) %，而沒有經(jīng)過包埋處理的產(chǎn)品，成活率只有 %（大部分是耐熱性強(qiáng)的芽孢桿菌）。因此，經(jīng)過微膠囊包埋后的 NBM 微生態(tài)制劑完全可以制成顆粒飼料，而有效活菌含量不會因制粒過程中的高溫而降低。 （三） NBM 制劑微膠囊包埋產(chǎn)品的酸穩(wěn)定性研究。 本研究通過模擬胃液（含胃酸 10%、胃蛋白酶 1%、 PH 值 ～ ）測定了 NBM 制劑微膠囊包埋產(chǎn)品的酸穩(wěn)定性。結(jié)果表明：經(jīng)微膠囊包埋處理后的 NBM 制劑，通過模擬胃液 2 小時后，活菌的存活率還高達(dá) %，卵黃免疫球蛋白的活性高達(dá) 97%。而未包埋的產(chǎn)品，活菌的成活率只有 %，免疫球蛋白的活性只有 91%，經(jīng)過 8 小時的試驗(yàn)后，包埋后的產(chǎn)品活菌成活率仍然還有 32%，而未包埋產(chǎn)品經(jīng)過 7小時后就已完全喪失了活性。 （四） NBM 制劑貯藏的穩(wěn)定性 在 NBM 制劑中，低聚木糖、卵黃免疫球蛋白及蠅蛆抗菌蛋白本身就具較強(qiáng)的貯藏穩(wěn)定性，但是活菌制劑的耐藏性能就比較差。研究結(jié)果表明，經(jīng)過微膠囊包埋處理的 NBM制劑，貯藏 6 個月后，活菌的存活率仍然高達(dá) %，而未經(jīng)包埋的產(chǎn)品只有 %的活菌存活率了。由此看來，微膠囊包埋技術(shù)，是 延長微生態(tài)制劑貨架期最有效的手段。貯藏更長的時間后，微膠囊包埋產(chǎn)品是否還具有較高的活性，仍需繼續(xù)研究。 八、 NBM 制劑抑菌能力的研究 （一）、菌制劑代謝產(chǎn)物的抑菌性 本研究將活菌制劑和“ EM 原”離心過濾后，取其上清液（代謝產(chǎn)物）進(jìn)行了抑菌試驗(yàn)，并以培養(yǎng)基作第一對照，以乳酸作第二對照。結(jié)果顯示，代謝產(chǎn)物對指示菌（動物腸道內(nèi)常見的有益菌和病原菌）中的大腸桿菌、沙門氏菌和枯草芽孢桿菌具有抑制作用，而對嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、青春雙歧桿菌沒有抑制作用。而活菌制劑的重要代謝產(chǎn)物乳酸，無論是對有益菌還是病原菌，都沒有抑 制作用。因此，本研究果證明，微生態(tài)制劑對病原菌起抑制作用的是其代謝產(chǎn)物，而這種代謝產(chǎn)物不是乳酸，而是乳酸以外的其他代謝物，如抗菌素等，具體是哪種物質(zhì)起關(guān)鍵作用，還有待更深入研究。 （二）、活菌制劑代謝產(chǎn)物濃度對抑菌作用的影響。 本研究將活菌制劑離心過濾，取上清液（代謝產(chǎn)物）凍干后加無菌水，制成 ～ 10倍濃縮液，以培養(yǎng)基作對照，進(jìn)行了抑菌試驗(yàn)。結(jié)果表明，代謝產(chǎn)物的濃度越大，對指示菌的大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌能力越強(qiáng)。 33 （三）、 NBM 制劑抑菌能力的比較 本研究比較了 NBM 制劑、單項(xiàng)活菌劑、單項(xiàng)低聚木糖、單項(xiàng) 免疫球蛋白、單項(xiàng)蠅蛆蛋白粉以及 EM 原的抑菌能力。結(jié)果表明， NBM 制劑的抑菌能力，明顯高于單一物質(zhì)和EM 原，但作用效果（從抑菌圈直徑大小上來看）并不是幾種單一物質(zhì)作用效果的累加。單一的低聚木糖，無論對哪種指示菌都沒有抑制作用，單一的卵黃免疫球蛋只對特異菌種（抗原）如大腸桿菌和沙門氏菌有抑制作用，而對其他的病原菌沒有作用。蠅蛆蛋白粉中起抑菌作用的主要成份是抗菌肽，是一種具有非特異免疫功能和廣譜性抗菌能力的物質(zhì)，對所有指示菌都有一定的抑制作用。 九、 NBM 制劑在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用研究 （一）、“春興液”微生態(tài)制劑飼養(yǎng) 斷奶仔豬的效果 試驗(yàn)于 2022 年 5 月 1 日～ 28 日，在 貴州 省 都勻壩固種畜場 進(jìn)行，用 28 日齡二元雜斷奶仔豬（長大） 30 頭，在基礎(chǔ)日糧中添加 %的 NBM 制劑飼喂 28 天。結(jié)果表明： 試驗(yàn)組日增重為 ，比對照（ ）提高 65。 83%。 試驗(yàn)組平均日采食量為 克 /日 .頭，比對照（ 克 /日 .頭）提高 % 試驗(yàn)組的料重（肉）比為 ： 1，對照組的料重（肉）比為 ： 1，試驗(yàn)組的飼料轉(zhuǎn)化率比對照提高了 %。 試驗(yàn)組腹瀉率為 %，比對照組（ %）降低了近 3 倍。 試驗(yàn)組成活率為 100%，比對照組（ %）提高近 20% 試驗(yàn)組的總體經(jīng)濟(jì)效益比對照提高 % 添加 NBM 制劑飼養(yǎng)斷奶仔豬的產(chǎn)投比為 ： 1，即每投入 1 元，可增值 元。 （二）、“春興液”微生態(tài)制劑飼養(yǎng)生長豬的效果 試驗(yàn)地點(diǎn)： 貴州省都勻壩固種畜場 萬頭良種豬繁育基地 試驗(yàn)時間： 2022 年 6 月 24 日 2022 年 7 月 24 日 試驗(yàn)對象： 78 日齡 NBM（杜長大）雜交生長豬 30 頭 添加劑量： NBM 制劑占日飼喂食量 % 試驗(yàn)結(jié)果： 組別 始重（ Kg） 末重（ Kg） 增重（ g） 日取食量（ g/d） 料重比 對照組 501 1396 34 試驗(yàn)組 628 1546 增（減） % +2 + 從以上結(jié)果可看出： 試驗(yàn)組日增重（ 628g/天）比對照組（ 501 克 /天）提高 % 試驗(yàn)組日采食量（ 546g/頭 .天）比對照組（ 1396 克 /頭 .天）提高 % 試驗(yàn)組料重比（ :1）比對照組（ ： 1）減少了 %，即飼料轉(zhuǎn)化率提高了% 經(jīng)濟(jì)效益：產(chǎn)投比 ： 1，即投入 1 元，可增值 元，總體經(jīng)濟(jì)效益比對照組提高 13% 試驗(yàn)組和對照組均無腹瀉和死亡現(xiàn)象。 第五節(jié)討論 一、微生態(tài)制劑的菌種問題 （一）、菌種的來源問題 在微生物的大家族里，可選作微生態(tài)制劑的菌種很多，包括細(xì)菌、真菌以及多來自土壤、腌制品、發(fā)酵食品、動物消化道和糞便等。全國各地的科研單位和生產(chǎn)單位，都在分離、篩選或利用其他理化手段、基因工程等技術(shù)來獲得具有特殊功能或多重功能的菌種。但是，經(jīng)自行選育出來的菌種，應(yīng)用到生產(chǎn)實(shí)踐中去，往往又受到一些限制。如新育菌株的 生理生化觀察、遺傳穩(wěn)定性的觀察，無毒、無害、無副作用的檢測，品種登記等工作需要一定的時間。從 2022 年〔 1〕起，農(nóng)業(yè)部對生產(chǎn)微生態(tài)制劑添加劑所需要的菌種來源，作了較嚴(yán)格的要求，菌種來源主要是中國科學(xué)院微生物研究所菌種保存中心等六家機(jī)構(gòu)。 （二）、菌種的同源性問題 微生態(tài)制劑的菌株必須具有黏附性才能在動物腸道中生存并發(fā)揮作用，外源菌株進(jìn)入動物腸道后，在腸道內(nèi)膜上的占位，會與腸道的內(nèi)源菌株系產(chǎn)生競爭或受排斥，因此，對微生態(tài)制劑菌株的同源性和其黏附性應(yīng)給予足夠的重視。 等 〔 2〕 報道，乳酸桿