制醫(yī)學(xué)課件生化rna結(jié)構(gòu)和功能-資料下載頁
2025-01-04 05:41本頁面
【正文】 分子雜交中的探針及其標(biāo)記物： 1） 核苷酸探針： 用 DNA合成儀合成 ， 長度一般在 1530個堿基 。 寡核苷酸探針由于片段小 ， 與受體結(jié)合的牢固程度低 ， 因而需要很好控制雜交條件 。 主要用于檢測受體的點(diǎn)突變 、 小段序列的插入或缺失 、 確實(shí)無其它探針而又需要分子雜交時 。 2） 基因組 DNA探針： 這是最常用的核酸探針 ， 多為某基因的全部或部分序列 （ 通常包括基因的外顯子 、內(nèi)含子 和部分旁側(cè)序列 ） 。 可從基因文庫中篩選出的基因組 DNA， 必要時須經(jīng)過人工改造 ， 其長度一般在 ， 通常保存在重組質(zhì)粒 DNA中 ， 用時通過限制性內(nèi)切酶切下 。 由于探針片段較大 ， 能與受體牢固結(jié)合 ， 分子雜交中容易操作 ， 因而 ， 它是分子雜交中首選探針 。 3） cDNA探針： mRNA反轉(zhuǎn)錄得到 cDNA， 此類來源探針的序列僅包括基因的外顯子而不包括基因的內(nèi)含子 和部分旁側(cè)序列 ， 但 cDNA探針不易獲得 。 4） RNA探針： mRNA探針是一類有特殊用途的核酸探針 ， 單鏈 RNA分子不存在互補(bǔ)雙鏈的競爭結(jié)合 ， 所以 ， 它與靶序列的雜交反應(yīng)效率較高； RNA中無高度重復(fù)序列 ， 非特異雜交較少；雜交后可用 RNase將未雜交的 RNA分子水解掉 ， 減少背景的干擾 。 缺點(diǎn)是真核 mRNA的 3′端有多聚 A尾而影響雜交的特異性 ， 可通過封閉樣品中的多聚 dU或多聚 dT而解決 。 分子雜交的結(jié)果是看能否與探針結(jié)合而形成雜合雙鏈，因此，雜交前需對探針進(jìn)行標(biāo)記 (Labelling)。標(biāo)記物有兩類：一是 放射性同位素標(biāo)記 (radioisotope label)。主要有： 32P、 35S、 3H、 125I等，如 [α－ 32P]dCTP、 [γ－32P]dATP、 [α－ 35S]dATP等。二 是非放射性物質(zhì)標(biāo)記(nonradioactive label)。如生物素 (biotin)、 光敏生物素（ photobiotin） 、 地高辛（ digoxigenin）補(bǔ)骨脂素等。關(guān)于探針的標(biāo)記方法，參見有關(guān)的“分子生物學(xué)”專業(yè)書籍。 4． 分子雜交的主要過程 (以 Southern雜交 為例 )： 1） 酶切： 對于大分子量的基因組 DNA， 雜交之前通常需用限制性內(nèi)切酶將 DNA酶切為較小的片斷 。 2） 電泳： 一般采用瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳將樣品的 DNA片斷分離開來 。 其中 ， 瓊脂糖凝膠電泳分離最常用 。 紫外下觀察 (最好用長波紫外線 )并作好凝膠的方位標(biāo)記 (如切去凝膠一角 )和照像紀(jì)錄電泳結(jié)果 。 3） 變性： 將凝膠置于 NaOH溶液中使雙鏈 DNA發(fā)生變性 。 隨后置于 TrisHCl中以中和 NaOH(單鏈 DNA不需要此步驟 )。 4） 轉(zhuǎn)移： 通過 Southern轉(zhuǎn)移或電轉(zhuǎn)移將凝膠中的 DNA按原位轉(zhuǎn)移至硝酸纖維薄膜或尼龍薄膜上 ， 并做好薄膜與凝膠之間位置關(guān)系的記號 。 固定：將轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素薄膜或尼龍薄膜上的 DNA固定在硝酸纖維素薄膜或尼龍薄膜上 (如將其置于 80℃干烤 2小時 )。 5） 預(yù)雜交： 目的在于盡可能減少薄膜對 DNA的非特異性的吸附 ， 從而抑制背景雜交 。 通常將固定后的薄膜與預(yù)雜交液一起封入塑料袋中 ， 置于一定溫度 (應(yīng)與隨后的雜交溫度相同 )下并經(jīng)過一定時間的預(yù)雜交 。 6） 標(biāo)記： 標(biāo)記探針并熱變性 (一般將標(biāo)記好的探針置于沸水浴 510分鐘 ， 取出后迅速置于冰浴至少 5分鐘 )。 7） 雜交： 將上述制備好的標(biāo)記探針加入已完成預(yù)雜交的塑料袋內(nèi) ， 封閉塑料袋并將其置于一定溫度下經(jīng)過一定時間的雜交 。 8） 洗膜： 除去薄膜上非特異吸附的標(biāo)記物 (包括標(biāo)記探針和未標(biāo)記上的游離標(biāo)記物 )。 一般采用控制洗滌溶液的溫度 、 離子強(qiáng)度和 SDS（ 一種非離子去垢劑 ） 濃度的辦法而達(dá)到洗膜的目的 。 9） 檢測： 即檢測薄膜上特異結(jié)合的標(biāo)記探針： 同位素標(biāo)記：放射自顯影技術(shù) 。 非同位素標(biāo)記：其它方法 。 10） 比較結(jié)果： 將檢測結(jié)果與凝膠照片對比 。 遺傳信息流動的中心法則 在生物界 ， 絕大多數(shù)生物的遺傳物質(zhì)是 DNA，近極少數(shù)生物是 RNA（ 如 RNA病毒 ） 。 那么 ，這些儲存在 DNA或 RNA中的遺傳信息到底怎樣一代一代地往下傳遞以及怎樣控制生物個體的性狀呢 ？ 這就是遺傳信息的流動方向的問題 。目前 ， 已總結(jié)出生物遺傳信息的流動規(guī)律即生物遺傳信息流動的中心法則 。 遺傳信息流動的中心法則 從中心法則的內(nèi)容來看 ， DNA可以自身為模板（ template） 而合成子代 DNA， 即將遺傳信息準(zhǔn)確地傳遞到子代 DNA分子中 ， 該過程稱為 DNA復(fù)制 （ DNA replication， 通常簡稱復(fù)制 ） ； RNA也可以其自身為模板而合成子代 RNA， 將其遺傳信息傳遞到子代 RNA分子中 ， 此過程稱為 RNA復(fù)制；同時 ， DNA也可作為模板合成 RNA， 將其遺傳信息傳遞到 RNA分子中 ， 此過程稱為 轉(zhuǎn)錄 （ transcripition） ；另外 ， RNA也可作為模板合成 DNA， 將其遺傳信息傳遞到 DNA分子中去 ， 此過程稱為逆轉(zhuǎn)錄或反轉(zhuǎn)錄 （ reverse transcripition） 。 再以RNA中的 mRNA為模板指導(dǎo)蛋白質(zhì)的生物合成 ， 這一過程稱為 翻譯 （ translation） 。
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