【導讀】初步了解顯微鏡的基本構造，能夠規(guī)范和較熟練地使用。普通光學顯微鏡是由機械系統(tǒng)、光學系統(tǒng)及光源系統(tǒng)3部分組成。其后方有一直立的短柱稱為鏡柱，它支持著鏡臺。調節(jié)左右鏡筒之間的水平距離，以適應觀察者兩眼的眼間距，可使左右?？祝Q通光孔，來自下方的光線可由此進入物鏡?？汕昂笞笥乙苿硬Ｆ瑯吮?。調節(jié)物鏡與所觀察標本之間的距離，獲得清晰的圖像。周粗的螺旋為粗調焦螺旋，其升降距離較大，主要用于尋找目的物。亦即成像系統(tǒng)，分別由目鏡和物鏡構成。舊式顯微鏡應首先將可變光闌的孔徑調至最大，將聚光器升至最高點，再將低倍鏡對準通光孔，鏡頭離載物臺約1cm。直至油鏡頭浸沒于香柏油內，幾乎與載玻片相接觸，但不能相碰。如果鏡頭已提出香柏油而尚未見到物像時，應按上述過程。1．總結使用顯微鏡應特別注意的幾個問題。

　　

【正文】 輪蟲的一般孵化方法。 學習輪蟲培養(yǎng)的一般工藝。 正確識別輪蟲的質量。 二、實驗器材： 電爐 2 個， 500mL 三角燒瓶 22 個，顯微鏡 5臺，體視顯微鏡 5 臺，膠頭滴管 22 個 ，凹玻片 22 片，輪蟲種。 三、實驗步驟 ： 休眠卵的孵化 輪蟲休眠卵孵化的鹽度范圍為 ，但以 1520 的鹽度最適宜。 休眠卵孵化的溫度范圍為 535℃，但孵化時間則隨溫度的不同而有明顯差異。最適宜的孵化溫度為 2025℃。在孵化容器中，加入少量扁藻或小球藻藻液，使水略呈很淡的藻色，有利于孵化。光照是結束在黑暗條件下休眠的必要條件。 為了避免敵害生物（小型甲殼動物）的危害，休眠卵孵化及培養(yǎng)所需的海水，需經300 目的篩絹網過濾，并加入淡水調節(jié)鹽度至最適范圍。 可用各種玻璃培養(yǎng)缸、小水族箱為孵 化容器，容器在使用前應清洗、消毒，再用過濾海水沖洗干凈。然后加入孵化用海水，并加入少量藻液。 把少量輪蟲休眠卵放入海水中孵化。休眠卵混有大量的藻渣，用量太久易引起水質變壞。孵化容器放置在靠近窗口或有人工照明的位置。孵化期間每天需攪拌數次，或微量充氣。 如果條件適宜，一般在 3—7天的時間內。即可孵化。由于在孵化容器內有大量死藻渣等雜質使水質欠佳，孵化后的輪蟲應及時吸移到備用的培養(yǎng)容器中培養(yǎng)。 輪蟲培養(yǎng) 水處理：各級培養(yǎng)最好采用消毒海水，也可用經嚴格過濾的海水，如用脫脂棉加 250目或 300 目篩絹過濾或細沙 過濾池過濾除去敵害生物。如果鹽度過高，必須加入淡水調節(jié)。因褶皺臂尾輪蟲喜歡有機質較多的水，可在培養(yǎng)海水加入 1%— 2%的人尿。 31 接種：一般要求每亳升水接種輪蟲 1—3 個，在適宜的條件下，經過 10 天左右的培養(yǎng)即可達到收獲的密度。接種的數量小些，除了需要較長的培養(yǎng)時間外，其他并無良影響。以面包酵母為餌料，其接種密度應大于以單胞藻為餌料的接種密度。 管理：單細胞藻類一般單獨培養(yǎng)投喂。每天投喂 2 次，投餌量不宜過多，以輪蟲能吃飽又不過剩為標準。一般掌握投餌量的標準是投餌后，培養(yǎng)海水呈淡的藻色，在下次投餌之前培養(yǎng)海水基本變 清。扁藻的投餌量是 萬 — 5 萬個細胞 /亳升 ,小新月菱形投餌量為 30 萬 — 50 萬個細胞 /毫升。在培養(yǎng)過程中，要隨著輪蟲數量的增加，相應增加投餌量或投餌次數。此外，環(huán)境條件（如水溫、水中銨態(tài)等）不同也影響攝餌量。因此，必須根據具體情況調節(jié)投餌量。 四、結束后，寫出實驗報告 第二、鹵蟲休眠卵的孵化 一、目的與要求 掌握輪蟲休眠卵的孵化方法和輪蟲的一般孵化方法。 學習輪蟲培養(yǎng)的一般工藝。 正確識別輪蟲的質量。 二、實驗器材： 電爐 2 個， 500mL 三角燒瓶 22 個，顯微鏡 5臺，體視顯微鏡 5 臺，膠頭滴管 22 個 ，凹玻片 22 片，輪蟲種。 三、實驗步驟： 孵化： 每升水可放卵 克，最高不宜超過 1 克。 鹽度范圍為 5140（中國塘沽品系為 5100），最適鹽度為 2830，但某些地理品系的卵，當鹽度為 5 時，孵化率提高，孵出的無節(jié)幼體能量大，活力強； pH 為 89；溶解氧大于等于 3 毫克 /升；光照不僅能影響卵子孵化率，還能影響卵的孵化速度，光的作用是觸發(fā)休眠卵重新開始發(fā)育，所以在孵化過程中（至少在經海水浸泡的頭幾個小時），連續(xù)進行 1000 勒克斯的光照可獲得較好的孵化效果 淡水比重分離法： 此法是利用無節(jié)幼蟲、卵殼、 未孵化卵的比重差異來將它們分離開來；將三者的混合物倒入盛有淡水的盆內，將盆傾斜靜置 3 分鐘。未孵化卵因比重大面沉降到盆底，無節(jié)幼蟲因淡水麻醉出現暫時休克也下沉到靠近底部，空卵殼比重最輕浮在水面。用虹吸法將無節(jié)幼蟲吸入網袋內，濾去談水。 32 實驗 10 常見浮游生物形態(tài)構造的觀察 一、目的要求： 觀察浮游生物的一般形態(tài)構造，識別常見的浮游生物。 二、儀器藥品： 新鮮或固定的硅藻、甲藻、原生動物標本、顯微鏡、吸管、載玻片、蓋玻片等。 三、實驗步驟： 取濃縮標本一滴，置載波片上，加蓋玻片 ，以低倍鏡找一個角毛藻等硅藻，再轉用高倍鏡觀察其細微構造。 A、群體由很多細胞連接而成，鏡中所見者往往為細胞環(huán)面觀。 B、細胞壁由上下殼構成，有突起、刺毛的，細胞往往借此連成群體，其間隙稱為細胞間隙。 C、殼面邊緣彎曲，與相連帶相連，殼面邊緣彎曲部分稱殼套，上下相連帶重合部分叫殼環(huán)。 D、細胞與細胞間有一定的間隙，叫細胞間隙。 E、有些群體兩端細胞的形狀與其他細胞不同。 腰鞭毛蟲（甲藻）應注意觀察鞭毛的情況（長短、數量著生位置等）、板式情況等。纖毛蟲注意觀察其外殼的形態(tài)，特別是外殼上附著的顆粒的情況、花紋的 情況。注意觀察不同種類間形態(tài)特征的差異。 四、作業(yè) ： 繪圖指出硅藻的殼面、殼環(huán)面、殼套、刺毛等。 繪出圓篩藻、盒形藻、根管藻、舟形藻（常見羽紋硅藻）的形態(tài)示意圖。 33 實驗 11 細菌數量的測定 一、目的和內容 （ 一） 目的：掌握細菌數量的測定方法。 （ 二 ） 內容： 計數板直接鏡檢計數。 載玻片直接鏡檢計數。 平板菌落計數。 二、實驗材料和用具 枯草芽孢桿菌（ Bacillus subtilis）斜面培養(yǎng)物（約培養(yǎng) lOh）、培養(yǎng) 5～ 7d 的大腸桿菌(E． coli)菌液。 牛肉膏蛋白胨培 養(yǎng)基、美藍染色液、結晶紫染色液、香柏油、二甲苯、無菌水。 顯微鏡、血細胞計數板、手動計數器、酒精燈、無菌吸管、濾紙條、載玻片、蓋玻片、無菌微量移液管、接種環(huán)、擦鏡低、無菌試管、涂布器、無菌培養(yǎng)皿。 三、操作步驟 （一）計數板直接鏡檢計數 1．血細胞計數板的構造 血細胞計數板由四條平行槽構成 3 個平臺，中間的平臺較寬，其中間又被一短槽隔成兩半，每邊平臺面各有一個含 9 個大格的方格網，中間大格為計數室。計數室的長和寬各為 1mm，中間平臺下陷 ，故蓋上蓋玻片后計數室的容積為 。血細胞計數板的構造見圖 16。 常見血細胞計數板的計數室有兩種規(guī)格。一種是 16 25型，稱為麥氏血細胞計數板，共有 16 個中格，每個中格分為 25 個小格。另一種是 25 16型，稱為希里格式血細胞計數板，共有 25 個中格，每個中格又分成 16 個小格。但是不管哪種規(guī)格的血細胞計板其計數室的小格均由 400 個小方格組成。應用血細胞計數板在顯微鏡下直接計算微生物細胞的數量，方法是先測定若干個方格中的微生物細胞，再換算成每 mL 菌液 (或每 g樣品 )中微生物細胞數量。 2．細菌數量的測定 （ 1）稀釋加樣：取枯草芽孢桿菌斜面少量菌體至 lOOmL 無菌水中，稀釋 混勻后待用（濃度約為 104— 105／ mL)。先將蓋玻片放在計數室上，用吸管吸取以上稀釋液滴于蓋玻片的邊緣，讓菌液自行滲入，多余菌液用濾紙吸去，稍待片刻，待細菌細胞全部沉 34 降到計數室底部，將計數板放于載物臺的中央，按下列步驟尋找計數室并計數。 （ 2）找計數室：先在低倍鏡下尋找計數板大方格網的位置，轉換高倍鏡后，調節(jié)光亮度至菌體和計數室線條清晰為止，再將計數室一角的小格移至視野中。順著大方格線移動計數板，使計數室位于視野中間。 （ 3）計數：計數時，如用 16 25型計數板則按對角線方位，取左上、右上、左下、右下 4 個 大格（共 4 個大格， 100 個小格）內的細胞逐一進行計數；如使用規(guī)格為 2516 型的計數板，則除取左上、右上、左下、右下 4 個大格外，還需加中央的一個大格（共5 個大格， 80 個小格）內的細胞。計數時當遇到大格線上的細菌時，一般只計此大格的上方及右方線上的細胞（或只計下方及左方線上的細胞），將計得的細胞數填入結果表中，對每個樣品重復計數 3 次，取其平均值，按下列公式計算每 mL 菌液中所含的細菌細胞數。 16 25 型血細胞計數板的計算公式： 稀釋倍數小格內細菌細胞數菌細胞數 ???? 1000400100100/ mL 25 16 型血細胞 計數板的計算公式： 稀釋倍數小格內細菌細胞數菌細胞數 ???? 104008080/ mL （二）載玻片直接鏡檢計數 1．搖動菌液使其混合均勻，用無菌微量移液管取菌液 于載玻片上，并用無菌接種環(huán)均勻地涂布在 1cm2的面積上。風干，固定，結晶紫染色 1min，沖洗，干燥備用。 2．用物鏡測微尺，測量顯微鏡油鏡觀察時的視野直徑，并以 S=π r2公式，計算出視野面積。 3．將涂片置于載物臺，滴香柏油，以油鏡觀察，不斷變化視野，共觀察 10 個視野，計數每一視野中細菌個數。以下列公式計算每毫升菌液中的含菌數量。 稀釋倍數視野中的平均菌數個視野的面積個原菌液菌數 ????? ? 1001 1/ 21 cmmL （三）平板菌落計數 另取滅菌移液管吸取上述枯草芽孢桿菌稀釋液 lmL，放入已滅菌的培養(yǎng)皿中，再倒入融化而冷卻到 50℃左右的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基同時制作 3 個平板，皿中鋪成一薄層，并使平皿作前后和左右滑動，使樣品和培養(yǎng)基混勻，待其凝固后倒置， 37℃培養(yǎng) 24h后計算菌落數，并計算其每 mL 的含菌量。 35 四、注意事項 直接鏡檢計數完畢，用蒸餾水沖洗計數板。絕不能用硬物洗刷。洗后待其自行晾干，或用濾紙沾干。最后用擦鏡紙擦干凈。若計數是病原微生物，則需先浸泡在 5％的石炭酸溶液中進行消毒，然后再進行清 洗。 五、演示 顯微鏡下顯示計數板計數室。 平板菌落計數操作過程。 六、實驗報告 （一）記錄實驗結果 計數板直接鏡檢計數結果： 計算次數 各大格中細胞數 大格中細胞總數 稀釋倍數 總菌數 /個 ml1或 g1 左上 右上 右下 左下 中間 第一次 第二次 第三次 平均值 36 涂片直接鏡檢計數結果： 視野 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 平均視野 待測樣品 /ml g1 菌數 3．平板菌落計數結果： 總菌數 /個 mL1或 g1＝每皿平均菌落數稀釋倍數 （二）比較以上 3種不同計數方法所得的結果并進行分析。 七、問題和思考 1．根據你的體會，血細胞計數板計算的誤差主要來自哪些方面 ?應如何減少誤差 2．比較各種計數法的優(yōu)點和缺點。 3．設計一個方案，如何計數市售酸奶或三株口服液或菌肥制品的單位含菌數。 37 第二部分 綜合性實驗 實驗 12 草履蟲的形態(tài)結構與生命活動 一、目的與內容 （一）目的 1．學習對運動活潑的微型動物的觀察和實驗方法。 2．通過實驗， 進一步認識和理解原生動物的單個細胞是獨立生活的動物有機體。 3．認識原生質具有應激性；了解草履蟲的科學研究價值。 （二）內容 1．草履蟲活體觀察和實驗。 2．生殖裝片的觀察。 二、材料與用品 （一）材料 大草履蟲培養(yǎng)液，草履蟲橫分裂及接合生殖的裝片。 （二）用品 顯微鏡、體視顯微鏡、秒表、鑷子、漏斗架、試管架、載玻片、蓋玻片、試管、滴管、毛細滴管、玻棒、燒杯、量筒、 1mL移液管（吸管）、漏斗、濾紙、精密 pH 試紙（ PH值范圍 ~ 和 ~）、吸水紙、脫指棉、橡皮吸球。 三、操作與觀察 （一 ）草履蟲的形態(tài)結構與運動 1．草履蟲臨時裝片的制備 為限制草履蟲的迅速游動以便觀察，先將少許棉花纖維撕松放在載玻片中部，再用滴管吸取草履蟲培養(yǎng)液滴 1 滴在棉花纖維之間，蓋上蓋玻片，在低倍鏡下觀察。如果草履蟲游動仍很快，則用吸水紙在蓋玻片的一側吸去部分水（注意不要吸干），再進行觀察。 2．草履蟲的外形與運動 在低倍鏡下，將光線適當調暗點，使草履蟲與背景之間有足夠的明暗反差?？梢姴萋南x形似倒置草鞋底，前端鈍圓，后端稍尖，體表密布纖毛，體末端纖毛較長。從蟲體前端開始，體表有一斜向后行直達體中部的凹溝稱口溝，口溝處有 較長而強的纖毛。 游泳時，草履蟲全身纖毛有節(jié)奏地呈波狀依次快速擺動，由于口溝的存在和該處纖 38 毛擺動有力，而使蟲體繞其中軸向左旋轉，沿螺旋狀路徑前進?！?當遇到阻擋物時，蟲體如何游動？ 3．內部構造 選擇 1 個比較清晰而又不太活動的草履蟲換高倍鏡觀察其內部構造。蟲體的表面是表膜，★ 注意當草履蟲穿過棉花纖維時，其體形可否改變，為什么 ？緊貼表膜的 1 層細胞質透明無顆粒，稱外質，外質內有許多與表膜垂直排列的折光性較強的橢圓形刺絲泡；外質以內的細胞質多顆粒，稱為內質。 蟲體腹面口溝末端有一胞口，胞口后連一深入內質的彎曲短 管，稱胞咽，胞咽壁上生有由長纖毛聯合形成的波動膜。★ 注意觀察口溝纖毛和胞咽波動膜的波動，其波動有何功用 ? 內質內大小不同的圓形泡，多為食物泡。在蟲體的前、后端各有一透明的圓形泡，可以伸縮，為伸縮泡。當伸縮泡主泡縮小時，可見其周圍有 6～ 7個放射狀排列的長形透明小管，即收集管?！?注意前后 2 個伸縮泡之間及伸縮泡的主泡與收集管之間在收縮上有何規(guī)律 ? 大草履蟲有大、小 2 個細胞核