【導(dǎo)讀】初步了解顯微鏡的基本構(gòu)造，能夠規(guī)范和較熟練地使用。普通光學(xué)顯微鏡是由機(jī)械系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)及光源系統(tǒng)3部分組成。其后方有一直立的短柱稱為鏡柱，它支持著鏡臺(tái)。調(diào)節(jié)左右鏡筒之間的水平距離，以適應(yīng)觀察者兩眼的眼間距，可使左右?？?，稱通光孔，來自下方的光線可由此進(jìn)入物鏡。可前后左右移動(dòng)玻片標(biāo)本。調(diào)節(jié)物鏡與所觀察標(biāo)本之間的距離，獲得清晰的圖像。周粗的螺旋為粗調(diào)焦螺旋，其升降距離較大，主要用于尋找目的物。亦即成像系統(tǒng)，分別由目鏡和物鏡構(gòu)成。舊式顯微鏡應(yīng)首先將可變光闌的孔徑調(diào)至最大，將聚光器升至最高點(diǎn)，再將低倍鏡對(duì)準(zhǔn)通光孔，鏡頭離載物臺(tái)約1cm。直至油鏡頭浸沒于香柏油內(nèi)，幾乎與載玻片相接觸，但不能相碰。如果鏡頭已提出香柏油而尚未見到物像時(shí)，應(yīng)按上述過程。1．總結(jié)使用顯微鏡應(yīng)特別注意的幾個(gè)問題。

　　

【正文】 輪蟲的一般孵化方法。 學(xué)習(xí)輪蟲培養(yǎng)的一般工藝。 正確識(shí)別輪蟲的質(zhì)量。 二、實(shí)驗(yàn)器材： 電爐 2 個(gè)， 500mL 三角燒瓶 22 個(gè)，顯微鏡 5臺(tái)，體視顯微鏡 5 臺(tái)，膠頭滴管 22 個(gè) ，凹玻片 22 片，輪蟲種。 三、實(shí)驗(yàn)步驟 ： 休眠卵的孵化 輪蟲休眠卵孵化的鹽度范圍為 ，但以 1520 的鹽度最適宜。 休眠卵孵化的溫度范圍為 535℃，但孵化時(shí)間則隨溫度的不同而有明顯差異。最適宜的孵化溫度為 2025℃。在孵化容器中，加入少量扁藻或小球藻藻液，使水略呈很淡的藻色，有利于孵化。光照是結(jié)束在黑暗條件下休眠的必要條件。 為了避免敵害生物（小型甲殼動(dòng)物）的危害，休眠卵孵化及培養(yǎng)所需的海水，需經(jīng)300 目的篩絹網(wǎng)過濾，并加入淡水調(diào)節(jié)鹽度至最適范圍。 可用各種玻璃培養(yǎng)缸、小水族箱為孵 化容器，容器在使用前應(yīng)清洗、消毒，再用過濾海水沖洗干凈。然后加入孵化用海水，并加入少量藻液。 把少量輪蟲休眠卵放入海水中孵化。休眠卵混有大量的藻渣，用量太久易引起水質(zhì)變壞。孵化容器放置在靠近窗口或有人工照明的位置。孵化期間每天需攪拌數(shù)次，或微量充氣。 如果條件適宜，一般在 3—7天的時(shí)間內(nèi)。即可孵化。由于在孵化容器內(nèi)有大量死藻渣等雜質(zhì)使水質(zhì)欠佳，孵化后的輪蟲應(yīng)及時(shí)吸移到備用的培養(yǎng)容器中培養(yǎng)。 輪蟲培養(yǎng) 水處理：各級(jí)培養(yǎng)最好采用消毒海水，也可用經(jīng)嚴(yán)格過濾的海水，如用脫脂棉加 250目或 300 目篩絹過濾或細(xì)沙 過濾池過濾除去敵害生物。如果鹽度過高，必須加入淡水調(diào)節(jié)。因褶皺臂尾輪蟲喜歡有機(jī)質(zhì)較多的水，可在培養(yǎng)海水加入 1%— 2%的人尿。 31 接種：一般要求每亳升水接種輪蟲 1—3 個(gè)，在適宜的條件下，經(jīng)過 10 天左右的培養(yǎng)即可達(dá)到收獲的密度。接種的數(shù)量小些，除了需要較長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間外，其他并無良影響。以面包酵母為餌料，其接種密度應(yīng)大于以單胞藻為餌料的接種密度。 管理：?jiǎn)渭?xì)胞藻類一般單獨(dú)培養(yǎng)投喂。每天投喂 2 次，投餌量不宜過多，以輪蟲能吃飽又不過剩為標(biāo)準(zhǔn)。一般掌握投餌量的標(biāo)準(zhǔn)是投餌后，培養(yǎng)海水呈淡的藻色，在下次投餌之前培養(yǎng)海水基本變 清。扁藻的投餌量是 萬 — 5 萬個(gè)細(xì)胞 /亳升 ,小新月菱形投餌量為 30 萬 — 50 萬個(gè)細(xì)胞 /毫升。在培養(yǎng)過程中，要隨著輪蟲數(shù)量的增加，相應(yīng)增加投餌量或投餌次數(shù)。此外，環(huán)境條件（如水溫、水中銨態(tài)等）不同也影響攝餌量。因此，必須根據(jù)具體情況調(diào)節(jié)投餌量。 四、結(jié)束后，寫出實(shí)驗(yàn)報(bào)告 第二、鹵蟲休眠卵的孵化 一、目的與要求 掌握輪蟲休眠卵的孵化方法和輪蟲的一般孵化方法。 學(xué)習(xí)輪蟲培養(yǎng)的一般工藝。 正確識(shí)別輪蟲的質(zhì)量。 二、實(shí)驗(yàn)器材： 電爐 2 個(gè)， 500mL 三角燒瓶 22 個(gè)，顯微鏡 5臺(tái)，體視顯微鏡 5 臺(tái)，膠頭滴管 22 個(gè) ，凹玻片 22 片，輪蟲種。 三、實(shí)驗(yàn)步驟： 孵化： 每升水可放卵 克，最高不宜超過 1 克。 鹽度范圍為 5140（中國(guó)塘沽品系為 5100），最適鹽度為 2830，但某些地理品系的卵，當(dāng)鹽度為 5 時(shí)，孵化率提高，孵出的無節(jié)幼體能量大，活力強(qiáng)； pH 為 89；溶解氧大于等于 3 毫克 /升；光照不僅能影響卵子孵化率，還能影響卵的孵化速度，光的作用是觸發(fā)休眠卵重新開始發(fā)育，所以在孵化過程中（至少在經(jīng)海水浸泡的頭幾個(gè)小時(shí)），連續(xù)進(jìn)行 1000 勒克斯的光照可獲得較好的孵化效果 淡水比重分離法： 此法是利用無節(jié)幼蟲、卵殼、 未孵化卵的比重差異來將它們分離開來；將三者的混合物倒入盛有淡水的盆內(nèi)，將盆傾斜靜置 3 分鐘。未孵化卵因比重大面沉降到盆底，無節(jié)幼蟲因淡水麻醉出現(xiàn)暫時(shí)休克也下沉到靠近底部，空卵殼比重最輕浮在水面。用虹吸法將無節(jié)幼蟲吸入網(wǎng)袋內(nèi)，濾去談水。 32 實(shí)驗(yàn) 10 常見浮游生物形態(tài)構(gòu)造的觀察 一、目的要求： 觀察浮游生物的一般形態(tài)構(gòu)造，識(shí)別常見的浮游生物。 二、儀器藥品： 新鮮或固定的硅藻、甲藻、原生動(dòng)物標(biāo)本、顯微鏡、吸管、載玻片、蓋玻片等。 三、實(shí)驗(yàn)步驟： 取濃縮標(biāo)本一滴，置載波片上，加蓋玻片 ，以低倍鏡找一個(gè)角毛藻等硅藻，再轉(zhuǎn)用高倍鏡觀察其細(xì)微構(gòu)造。 A、群體由很多細(xì)胞連接而成，鏡中所見者往往為細(xì)胞環(huán)面觀。 B、細(xì)胞壁由上下殼構(gòu)成，有突起、刺毛的，細(xì)胞往往借此連成群體，其間隙稱為細(xì)胞間隙。 C、殼面邊緣彎曲，與相連帶相連，殼面邊緣彎曲部分稱殼套，上下相連帶重合部分叫殼環(huán)。 D、細(xì)胞與細(xì)胞間有一定的間隙，叫細(xì)胞間隙。 E、有些群體兩端細(xì)胞的形狀與其他細(xì)胞不同。 腰鞭毛蟲（甲藻）應(yīng)注意觀察鞭毛的情況（長(zhǎng)短、數(shù)量著生位置等）、板式情況等。纖毛蟲注意觀察其外殼的形態(tài)，特別是外殼上附著的顆粒的情況、花紋的 情況。注意觀察不同種類間形態(tài)特征的差異。 四、作業(yè) ： 繪圖指出硅藻的殼面、殼環(huán)面、殼套、刺毛等。 繪出圓篩藻、盒形藻、根管藻、舟形藻（常見羽紋硅藻）的形態(tài)示意圖。 33 實(shí)驗(yàn) 11 細(xì)菌數(shù)量的測(cè)定 一、目的和內(nèi)容 （ 一） 目的：掌握細(xì)菌數(shù)量的測(cè)定方法。 （ 二 ） 內(nèi)容： 計(jì)數(shù)板直接鏡檢計(jì)數(shù)。 載玻片直接鏡檢計(jì)數(shù)。 平板菌落計(jì)數(shù)。 二、實(shí)驗(yàn)材料和用具 枯草芽孢桿菌（ Bacillus subtilis）斜面培養(yǎng)物（約培養(yǎng) lOh）、培養(yǎng) 5～ 7d 的大腸桿菌(E． coli)菌液。 牛肉膏蛋白胨培 養(yǎng)基、美藍(lán)染色液、結(jié)晶紫染色液、香柏油、二甲苯、無菌水。 顯微鏡、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、手動(dòng)計(jì)數(shù)器、酒精燈、無菌吸管、濾紙條、載玻片、蓋玻片、無菌微量移液管、接種環(huán)、擦鏡低、無菌試管、涂布器、無菌培養(yǎng)皿。 三、操作步驟 （一）計(jì)數(shù)板直接鏡檢計(jì)數(shù) 1．血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的構(gòu)造 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板由四條平行槽構(gòu)成 3 個(gè)平臺(tái)，中間的平臺(tái)較寬，其中間又被一短槽隔成兩半，每邊平臺(tái)面各有一個(gè)含 9 個(gè)大格的方格網(wǎng)，中間大格為計(jì)數(shù)室。計(jì)數(shù)室的長(zhǎng)和寬各為 1mm，中間平臺(tái)下陷 ，故蓋上蓋玻片后計(jì)數(shù)室的容積為 。血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的構(gòu)造見圖 16。 常見血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室有兩種規(guī)格。一種是 16 25型，稱為麥?zhǔn)涎?xì)胞計(jì)數(shù)板，共有 16 個(gè)中格，每個(gè)中格分為 25 個(gè)小格。另一種是 25 16型，稱為希里格式血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，共有 25 個(gè)中格，每個(gè)中格又分成 16 個(gè)小格。但是不管哪種規(guī)格的血細(xì)胞計(jì)板其計(jì)數(shù)室的小格均由 400 個(gè)小方格組成。應(yīng)用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)算微生物細(xì)胞的數(shù)量，方法是先測(cè)定若干個(gè)方格中的微生物細(xì)胞，再換算成每 mL 菌液 (或每 g樣品 )中微生物細(xì)胞數(shù)量。 2．細(xì)菌數(shù)量的測(cè)定 （ 1）稀釋加樣：取枯草芽孢桿菌斜面少量菌體至 lOOmL 無菌水中，稀釋 混勻后待用（濃度約為 104— 105／ mL)。先將蓋玻片放在計(jì)數(shù)室上，用吸管吸取以上稀釋液滴于蓋玻片的邊緣，讓菌液自行滲入，多余菌液用濾紙吸去，稍待片刻，待細(xì)菌細(xì)胞全部沉 34 降到計(jì)數(shù)室底部，將計(jì)數(shù)板放于載物臺(tái)的中央，按下列步驟尋找計(jì)數(shù)室并計(jì)數(shù)。 （ 2）找計(jì)數(shù)室：先在低倍鏡下尋找計(jì)數(shù)板大方格網(wǎng)的位置，轉(zhuǎn)換高倍鏡后，調(diào)節(jié)光亮度至菌體和計(jì)數(shù)室線條清晰為止，再將計(jì)數(shù)室一角的小格移至視野中。順著大方格線移動(dòng)計(jì)數(shù)板，使計(jì)數(shù)室位于視野中間。 （ 3）計(jì)數(shù)：計(jì)數(shù)時(shí)，如用 16 25型計(jì)數(shù)板則按對(duì)角線方位，取左上、右上、左下、右下 4 個(gè) 大格（共 4 個(gè)大格， 100 個(gè)小格）內(nèi)的細(xì)胞逐一進(jìn)行計(jì)數(shù)；如使用規(guī)格為 2516 型的計(jì)數(shù)板，則除取左上、右上、左下、右下 4 個(gè)大格外，還需加中央的一個(gè)大格（共5 個(gè)大格， 80 個(gè)小格）內(nèi)的細(xì)胞。計(jì)數(shù)時(shí)當(dāng)遇到大格線上的細(xì)菌時(shí)，一般只計(jì)此大格的上方及右方線上的細(xì)胞（或只計(jì)下方及左方線上的細(xì)胞），將計(jì)得的細(xì)胞數(shù)填入結(jié)果表中，對(duì)每個(gè)樣品重復(fù)計(jì)數(shù) 3 次，取其平均值，按下列公式計(jì)算每 mL 菌液中所含的細(xì)菌細(xì)胞數(shù)。 16 25 型血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的計(jì)算公式： 稀釋倍數(shù)小格內(nèi)細(xì)菌細(xì)胞數(shù)菌細(xì)胞數(shù) ???? 1000400100100/ mL 25 16 型血細(xì)胞 計(jì)數(shù)板的計(jì)算公式： 稀釋倍數(shù)小格內(nèi)細(xì)菌細(xì)胞數(shù)菌細(xì)胞數(shù) ???? 104008080/ mL （二）載玻片直接鏡檢計(jì)數(shù) 1．搖動(dòng)菌液使其混合均勻，用無菌微量移液管取菌液 于載玻片上，并用無菌接種環(huán)均勻地涂布在 1cm2的面積上。風(fēng)干，固定，結(jié)晶紫染色 1min，沖洗，干燥備用。 2．用物鏡測(cè)微尺，測(cè)量顯微鏡油鏡觀察時(shí)的視野直徑，并以 S=π r2公式，計(jì)算出視野面積。 3．將涂片置于載物臺(tái)，滴香柏油，以油鏡觀察，不斷變化視野，共觀察 10 個(gè)視野，計(jì)數(shù)每一視野中細(xì)菌個(gè)數(shù)。以下列公式計(jì)算每毫升菌液中的含菌數(shù)量。 稀釋倍數(shù)視野中的平均菌數(shù)個(gè)視野的面積個(gè)原菌液菌數(shù) ????? ? 1001 1/ 21 cmmL （三）平板菌落計(jì)數(shù) 另取滅菌移液管吸取上述枯草芽孢桿菌稀釋液 lmL，放入已滅菌的培養(yǎng)皿中，再倒入融化而冷卻到 50℃左右的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基同時(shí)制作 3 個(gè)平板，皿中鋪成一薄層，并使平皿作前后和左右滑動(dòng)，使樣品和培養(yǎng)基混勻，待其凝固后倒置， 37℃培養(yǎng) 24h后計(jì)算菌落數(shù)，并計(jì)算其每 mL 的含菌量。 35 四、注意事項(xiàng) 直接鏡檢計(jì)數(shù)完畢，用蒸餾水沖洗計(jì)數(shù)板。絕不能用硬物洗刷。洗后待其自行晾干，或用濾紙沾干。最后用擦鏡紙擦干凈。若計(jì)數(shù)是病原微生物，則需先浸泡在 5％的石炭酸溶液中進(jìn)行消毒，然后再進(jìn)行清 洗。 五、演示 顯微鏡下顯示計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)室。 平板菌落計(jì)數(shù)操作過程。 六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告 （一）記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果 計(jì)數(shù)板直接鏡檢計(jì)數(shù)結(jié)果： 計(jì)算次數(shù) 各大格中細(xì)胞數(shù) 大格中細(xì)胞總數(shù) 稀釋倍數(shù) 總菌數(shù) /個(gè) ml1或 g1 左上 右上 右下 左下 中間 第一次 第二次 第三次 平均值 36 涂片直接鏡檢計(jì)數(shù)結(jié)果： 視野 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 平均視野 待測(cè)樣品 /ml g1 菌數(shù) 3．平板菌落計(jì)數(shù)結(jié)果： 總菌數(shù) /個(gè) mL1或 g1＝每皿平均菌落數(shù)稀釋倍數(shù) （二）比較以上 3種不同計(jì)數(shù)方法所得的結(jié)果并進(jìn)行分析。 七、問題和思考 1．根據(jù)你的體會(huì)，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算的誤差主要來自哪些方面 ?應(yīng)如何減少誤差 2．比較各種計(jì)數(shù)法的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。 3．設(shè)計(jì)一個(gè)方案，如何計(jì)數(shù)市售酸奶或三株口服液或菌肥制品的單位含菌數(shù)。 37 第二部分 綜合性實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn) 12 草履蟲的形態(tài)結(jié)構(gòu)與生命活動(dòng) 一、目的與內(nèi)容 （一）目的 1．學(xué)習(xí)對(duì)運(yùn)動(dòng)活潑的微型動(dòng)物的觀察和實(shí)驗(yàn)方法。 2．通過實(shí)驗(yàn)， 進(jìn)一步認(rèn)識(shí)和理解原生動(dòng)物的單個(gè)細(xì)胞是獨(dú)立生活的動(dòng)物有機(jī)體。 3．認(rèn)識(shí)原生質(zhì)具有應(yīng)激性；了解草履蟲的科學(xué)研究?jī)r(jià)值。 （二）內(nèi)容 1．草履蟲活體觀察和實(shí)驗(yàn)。 2．生殖裝片的觀察。 二、材料與用品 （一）材料 大草履蟲培養(yǎng)液，草履蟲橫分裂及接合生殖的裝片。 （二）用品 顯微鏡、體視顯微鏡、秒表、鑷子、漏斗架、試管架、載玻片、蓋玻片、試管、滴管、毛細(xì)滴管、玻棒、燒杯、量筒、 1mL移液管（吸管）、漏斗、濾紙、精密 pH 試紙（ PH值范圍 ~ 和 ~）、吸水紙、脫指棉、橡皮吸球。 三、操作與觀察 （一 ）草履蟲的形態(tài)結(jié)構(gòu)與運(yùn)動(dòng) 1．草履蟲臨時(shí)裝片的制備 為限制草履蟲的迅速游動(dòng)以便觀察，先將少許棉花纖維撕松放在載玻片中部，再用滴管吸取草履蟲培養(yǎng)液滴 1 滴在棉花纖維之間，蓋上蓋玻片，在低倍鏡下觀察。如果草履蟲游動(dòng)仍很快，則用吸水紙?jiān)谏w玻片的一側(cè)吸去部分水（注意不要吸干），再進(jìn)行觀察。 2．草履蟲的外形與運(yùn)動(dòng) 在低倍鏡下，將光線適當(dāng)調(diào)暗點(diǎn)，使草履蟲與背景之間有足夠的明暗反差?？梢姴萋南x形似倒置草鞋底，前端鈍圓，后端稍尖，體表密布纖毛，體末端纖毛較長(zhǎng)。從蟲體前端開始，體表有一斜向后行直達(dá)體中部的凹溝稱口溝，口溝處有 較長(zhǎng)而強(qiáng)的纖毛。 游泳時(shí)，草履蟲全身纖毛有節(jié)奏地呈波狀依次快速擺動(dòng)，由于口溝的存在和該處纖 38 毛擺動(dòng)有力，而使蟲體繞其中軸向左旋轉(zhuǎn)，沿螺旋狀路徑前進(jìn)?！?當(dāng)遇到阻擋物時(shí)，蟲體如何游動(dòng)？ 3．內(nèi)部構(gòu)造 選擇 1 個(gè)比較清晰而又不太活動(dòng)的草履蟲換高倍鏡觀察其內(nèi)部構(gòu)造。蟲體的表面是表膜，★ 注意當(dāng)草履蟲穿過棉花纖維時(shí)，其體形可否改變，為什么 ？緊貼表膜的 1 層細(xì)胞質(zhì)透明無顆粒，稱外質(zhì)，外質(zhì)內(nèi)有許多與表膜垂直排列的折光性較強(qiáng)的橢圓形刺絲泡；外質(zhì)以內(nèi)的細(xì)胞質(zhì)多顆粒，稱為內(nèi)質(zhì)。 蟲體腹面口溝末端有一胞口，胞口后連一深入內(nèi)質(zhì)的彎曲短 管，稱胞咽，胞咽壁上生有由長(zhǎng)纖毛聯(lián)合形成的波動(dòng)膜?！?注意觀察口溝纖毛和胞咽波動(dòng)膜的波動(dòng)，其波動(dòng)有何功用 ? 內(nèi)質(zhì)內(nèi)大小不同的圓形泡，多為食物泡。在蟲體的前、后端各有一透明的圓形泡，可以伸縮，為伸縮泡。當(dāng)伸縮泡主泡縮小時(shí)，可見其周圍有 6～ 7個(gè)放射狀排列的長(zhǎng)形透明小管，即收集管。★ 注意前后 2 個(gè)伸縮泡之間及伸縮泡的主泡與收集管之間在收縮上有何規(guī)律 ? 大草履蟲有大、小 2 個(gè)細(xì)胞核