pcr污染與對(duì)策-資料下載頁(yè)
2025-08-12 00:05本頁(yè)面
【導(dǎo)讀】即可造成假陽(yáng)性的產(chǎn)生.染;有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散，導(dǎo)致彼此間的污染.PCR核酸模板污染.013拷貝/ml)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測(cè)數(shù)個(gè)拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物污染，就可造成假陽(yáng)就可形。經(jīng)自己使用穩(wěn)定，檢驗(yàn)人員心中有數(shù)時(shí)，在以后的實(shí)驗(yàn)中可免設(shè)陽(yáng)性對(duì)照.或RNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以監(jiān)測(cè)試劑是否污染.（二）分裝試劑：PCR擴(kuò)增所需要的試劑均應(yīng)在裝有紫外燈的超凈工作臺(tái)或負(fù)壓工作臺(tái)配制和分裝。1．PCR用水應(yīng)為高壓的雙蒸水；2．引物和dNTP用高壓的雙蒸水在無(wú)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)配制；如沒(méi)有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過(guò)程中加樣器應(yīng)該專用，不能交。叉使用，尤其是PCR產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個(gè)區(qū)；水浸泡；3）取5ml做PCR實(shí)驗(yàn)；4）電泳檢測(cè)結(jié)果。如果經(jīng)過(guò)上述追蹤實(shí)驗(yàn)，仍不能查找到確切污染源，則污染可能是由空氣中PCR產(chǎn)物的氣溶
【正文】 大量 dU。在再次進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增前，用 UNG 處理 PCR混合液即可消除 PCR 產(chǎn)物的殘留污染。由于 UNG 在 PCR 循環(huán)中的變性一步便可被滅活，因此不會(huì)影響含 dU 的新的 PCR 產(chǎn)物。 3. dU引物法：合成引物時(shí)以 dU 代 dT，這樣 PCR 產(chǎn)物中僅 5ˊ端帶 dU。 UNG 處理后，引物失去了結(jié)合位點(diǎn)而不能擴(kuò)增。對(duì)長(zhǎng)片段（ 12kb 以上）的擴(kuò)增用 dUTP 法效率較用 dTTP 低，而用 dU 法就可克服這一缺點(diǎn)。 dU 引物最好將 dU 設(shè)計(jì)在 3ˊ端或近 ˊ端。該法僅能用于引物以外試劑的處理。 4. 優(yōu)點(diǎn)：可以去除任何來(lái)源的污染； UNG 處 理可以和 PCR 擴(kuò)增在同一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行；由于擴(kuò)增產(chǎn)物中有大量 dU 存在，可徹底消除污染源。 5. 需注意的是摻入 dUTP 的 DNA不應(yīng)對(duì)產(chǎn)物的任何操作有影響，在進(jìn)行 PCR 產(chǎn)物克隆時(shí)，應(yīng)該轉(zhuǎn)化 UNG（ UNG 缺陷）大腸桿菌受體菌，否則轉(zhuǎn)化產(chǎn)物會(huì)被受體菌 UNG 消化掉。 （四） 固相捕獲法 用于去除標(biāo)本中污染的核酸和雜質(zhì)，原理如下： 1）用一生物素標(biāo)記的單鏈 RNA探針與待擴(kuò)核酸雜交，雜交區(qū)域是非擴(kuò)增區(qū)； 2）用包被鏈霉親和素的固相載體來(lái)捕獲帶有生物素探針的雜交核酸，通過(guò)漂洗可去除污染的擴(kuò)增產(chǎn)物和雜質(zhì)； 3）洗脫靶分子后用 特異引物擴(kuò)增非 RNA探針雜交區(qū)域。第 2）步的漂洗后可用PCR 檢測(cè)以確定標(biāo)本是否被擴(kuò)增產(chǎn)物或重組質(zhì)粒污染。 （五） RSPCR 法（ RNAspecific PCR） 也稱為鏈特異性 PCR，主要指用于 RNA模板的特異性 PCR 法，該法可明顯降低假陽(yáng)性而不影響 PCR 的敏感性。其關(guān)鍵在于設(shè)計(jì)引物，逆轉(zhuǎn)錄引物的 3ˊ端（ A區(qū)）有 2 0 個(gè)核苷酸左右為模板的特異性互不序列，5ˊ端 2 0 個(gè)核苷酸（ C 區(qū)）為附加修飾堿基。與 mRNA逆轉(zhuǎn)錄后，經(jīng)超速離心使 cDNA與多余引物分開(kāi)，再用和第二引物（ C）以第一鏈 cDNA為模板合成第二 鏈 cDNA，以后的 PCR 循環(huán)中用逆轉(zhuǎn)錄引物的 B 區(qū)和引物 C 進(jìn)行擴(kuò)增加尾 cDNA，而污染的 DNA或質(zhì)粒 DNA才不會(huì)被擴(kuò)增。 （六）抗污染引物法 該對(duì)引物擴(kuò)增時(shí)通過(guò)病毒 DNA克隆如入質(zhì)粒的位點(diǎn)。這一區(qū)域只存在完整的原病毒中，在重組質(zhì)粒中，這一區(qū)域分成兩個(gè)區(qū)域與克隆位點(diǎn)被。如果重組質(zhì)粒污染了標(biāo)本，也不能擴(kuò)增出任何條帶，即使出現(xiàn)了擴(kuò)增帶，其大小也與預(yù)期的不同。只有原病毒 DNA才能被引物擴(kuò)增，因此只要出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增帶就可以證明標(biāo)本是陽(yáng)性的，該法試用于環(huán)狀靶分子系列。
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