【文章內(nèi)容簡介】 生長有重要的作用。167。 軟骨類型通常來講，根據(jù)基質(zhì)的特性不同，軟骨分為三種類型：（1）透明軟骨，（2）纖維軟骨，（3）彈性軟骨。透明軟骨基質(zhì)中的膠原纖維含量較少，主要是II型膠原，沒有典型的周期結(jié)構(gòu)。彈性軟骨基質(zhì)除了膠原纖維和基質(zhì)外，其軟骨基質(zhì)還包含大量的彈性纖維和層狀的彈性物質(zhì)，相互交織成網(wǎng)狀。彈性物質(zhì)提高了軟骨的彈性，外耳軟骨的良好柔韌性即是很好的證明。同透明軟骨不同的是，彈性軟骨基質(zhì)不礦化。纖維軟骨的基質(zhì)包含有大量的很明顯的粗膠原纖維簇，主要是I型膠原，平行或交錯，軟骨細(xì)胞較小而少，常成行排列。透明軟骨：透明軟骨具有玻璃狀的，均一的不定型基質(zhì)。在軟骨中分布著許多被稱作陷窩的腔，陷窩內(nèi)是軟骨細(xì)胞。陷窩周圍是胞外基質(zhì)，它由兩種組元構(gòu)成：膠原纖維（主要是II型膠原）和基質(zhì)。透明軟骨的基質(zhì)的化學(xué)分析表明了三種糖胺聚糖的存在：透明質(zhì)酸，硫酸軟骨素和硫酸角質(zhì)素。硫酸軟骨素和硫酸角質(zhì)素結(jié)合在軸心蛋白上形成了蛋白多糖單體。在組織中，透明質(zhì)酸和大約80個蛋白多糖單元聯(lián)合形成大的聚合體，其結(jié)構(gòu)由連接蛋白所加固。軟骨基質(zhì)也包含其它的不形成聚合體的蛋白多糖和無膠原、無蛋白多糖的糖蛋白。同其它的基質(zhì)一樣，軟骨基質(zhì)也是高度水合的。透明軟骨凈重的60%78%是水。這些水的大部分是結(jié)合水，這正解釋了軟骨的回彈性。然而，一些水結(jié)合較弱，足以允許小溶質(zhì)的擴散。在關(guān)節(jié)軟骨中，水的含量有局部的改變。這些改變發(fā)生在關(guān)節(jié)的運動過程中和關(guān)節(jié)受壓時。高度的含水量和水的運動影響軟骨基質(zhì)對壓載荷的改變作出的反應(yīng)及軟骨的承重能力。盡管透明軟骨的基質(zhì)是均一的，無定型的，但基質(zhì)的成分并不是均勻分布。因為大量的硫酸鹽類的存在，蛋白多糖經(jīng)基本染劑和蘇木青染色，這樣，在軟骨染色的斷面上嗜堿性細(xì)胞增多的現(xiàn)象提供了硫酸鹽類蛋白多糖的分布信息。這些物質(zhì)迅速集中在陷窩的周圍。這一環(huán)狀的深度染色基質(zhì)被傳統(tǒng)的組織學(xué)家命名為被膜。在細(xì)胞團簇附近也有一些濃度稍低的硫酸鹽類蛋白多糖，這些區(qū)域被稱為區(qū)基質(zhì)。在離細(xì)胞較遠(yuǎn)的基質(zhì)區(qū)域硫酸鹽蛋白多糖的含量很低，這些區(qū)域被稱為區(qū)間基質(zhì)。除了存在蛋白多糖分布的區(qū)域差別，同時還存在與年齡有關(guān)的差別，即隨著軟骨年齡的增長，蛋白多糖含量減少。167。 軟骨生長軟骨存在兩種生長方式。1. 內(nèi)積生長（interstitial growth）：軟骨細(xì)胞在軟骨基質(zhì)內(nèi)可繼續(xù)發(fā)育、分裂和不斷產(chǎn)生新的基質(zhì)和纖維，使軟骨從內(nèi)部生長。2. 外加生長（appositional growth）：由軟骨膜內(nèi)層的骨原細(xì)胞向軟骨表面不斷添加新的軟骨細(xì)胞和細(xì)胞間質(zhì)，使軟骨從表面向周圍擴大。167。 軟骨骨化生物內(nèi)大多數(shù)的軟骨在生長過程中逐漸替換成骨。軟骨骨化包括軟骨周骨化和軟骨內(nèi)骨化。1. 軟骨周骨化 軟骨膜內(nèi)層的骨原細(xì)胞分裂分化為成骨細(xì)胞，在軟骨表面形成類骨質(zhì)，稱為骨領(lǐng)。骨領(lǐng)不斷鈣化為骨質(zhì)并向骨的兩端擴展，逐漸形成骨干。2. 軟骨內(nèi)骨化 骨領(lǐng)包圍的軟骨部分，軟骨細(xì)胞肥大，軟骨基質(zhì)迅速鈣化，隨后軟骨細(xì)胞因缺乏營養(yǎng)而迅速退化死亡。骨膜的血管連同破骨細(xì)胞和骨原細(xì)胞等穿越骨領(lǐng)，進入軟骨。破骨細(xì)胞將鈣化的軟骨基質(zhì)逐漸分解吸收，形成了許多與骨干長軸平行并相互連通的隧道，即原始的骨髓腔。然后，骨原細(xì)胞分裂分化為成骨細(xì)胞，在殘留的鈣化軟骨基質(zhì)表面形成類骨質(zhì)，并漸鈣化為骨質(zhì)，形成許多骨小梁，軟骨內(nèi)出現(xiàn)了初級骨化中心。初級軟骨中心由骨干中央向兩端不斷擴展。同時骨領(lǐng)也不斷增長、增厚，使長骨增長和骨化。軟骨內(nèi)骨化是骨發(fā)生、生長和損傷修復(fù)的一種成骨方式。在成骨過程中軟骨組織中的肥大軟骨細(xì)胞分泌基質(zhì)、鈣化、死亡，軟骨組織退變、崩解、被吸收，血管侵入，成骨細(xì)胞產(chǎn)生骨組織。目前對體外（in vitro）、在體（in vivo）軟骨、骨組織和細(xì)胞活動的研究手段主要有核酸雜交技術(shù)、免疫組織化學(xué)、組織計量學(xué)和放射自顯影技術(shù)等。對細(xì)胞活動的定性、定位及其定量主要依靠其特征性產(chǎn)物來確定。軟骨細(xì)胞可產(chǎn)生特征性的Ⅱ、Ⅸ和Ⅹ型膠原，肥大軟骨細(xì)胞還可產(chǎn)生特征性的Ⅹ型膠原。各期的軟骨細(xì)胞均有酸性磷酸酶的活動。骨鈣素是成骨細(xì)胞的特征性產(chǎn)物，它是骨中最豐富的非膠原蛋白，它的ｍＲＮＡ表達(dá)說明細(xì)胞具有成骨的特性。骨橋素對細(xì)胞增殖和礦化很重要，膜內(nèi)化骨和軟骨內(nèi)化骨組織中，前成骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞中均含有這種蛋白。骨涎蛋白在礦化組織的細(xì)胞內(nèi)存在，認(rèn)為它是羥基磷灰石的晶核。骨連接素是一種酸性磷蛋白，最先在骨基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)，含量豐富，以后在包括軟骨細(xì)胞的各種其它細(xì)胞中均有表達(dá)和分泌。167。3. 斑馬魚120h內(nèi)的發(fā)育特點167。 斑馬魚——發(fā)育生物學(xué)研究的最佳脊椎動物模型在脊椎動物發(fā)育生物學(xué)研究方面，由于缺少適當(dāng)?shù)难芯磕Ｐ?，有關(guān)早期發(fā)育階段，基因表達(dá)調(diào)控的研究始終未獲突破性進展。包括小鼠、雞、爪蟾等在內(nèi)的一些脊椎動物都只適用于胚胎學(xué)或者遺傳學(xué)某一學(xué)科的研究，均不是理想的發(fā)育生物學(xué)研究模型。小鼠的胚胎太小，幼體和成體又太大，這使得進行大規(guī)模的突變體實驗有很大的困難。此外，小鼠的胚胎又在體內(nèi)，很難移動。雞和爪蟾都是很好的胚胎學(xué)研究模型，但它們繁殖慢，記錄后代的遺傳信息很困難，并且母體太大，價格昂貴，不適合大規(guī)模突變體研究。而一種小型的鯉科魚——斑馬魚，由于其諸多的優(yōu)點，逐漸成為發(fā)育生物學(xué)研究的最佳脊椎動物模型。斑馬魚個體小，成體只有34cm，并且價格便宜，易于在實驗室內(nèi)大規(guī)模的養(yǎng)殖。同時，斑馬魚產(chǎn)卵量大（幾十到上百），產(chǎn)卵周期短（幾天到兩周），卵大，胚胎在體外發(fā)育，胚胎發(fā)育速度快，通常23天即發(fā)育成幼體。而在轉(zhuǎn)基因的研究中注入的mRNA通常在48小時后降解，對于斑馬魚來說，因其胚胎發(fā)育速度快，所以基因有足夠的時間進行表達(dá)。斑馬魚早期的胚胎完全透明，單倍體、雌核發(fā)育二倍體的制作和突變體的獲得均較容易。這些特點使它成為很好的脊椎動物胚胎學(xué)、遺傳學(xué)研究模型。此外，盡管斑馬魚不是哺乳動物，但它作為脊椎動物與人體有一定的相似之處，對斑馬魚某些基因及其軟骨、骨的礦化機制的研究對人體的發(fā)育及同源基因的表達(dá)等方面均有重要的意義。同時，從基因水平上研究軟骨、骨的發(fā)育和礦化對人類仿生材料的研制提供了重要的依據(jù)。167。 斑馬魚幼體縱截面組織切片圖1. 24h的斑馬魚圖11圖122. 48h的斑馬魚圖13 圖1 43. 120h的斑馬魚圖15圖16167。4. 生物礦化生物礦化是指在生物體內(nèi)形成礦化材料的過程。由細(xì)胞分泌的有機物自組裝成的有機物對無機物的形成和聚集起模板和控制作用?；|(zhì)和礦物間動態(tài)的相互協(xié)調(diào)作用，才使得無機礦物具有一定的形狀、尺寸、取向和結(jié)構(gòu)。生物礦化過程是一個天然存在的高度控制過程，該過程受基因、細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的調(diào)制，在分子水平到介觀水平上對晶體形狀、大小、結(jié)構(gòu)、位向和排列實現(xiàn)精確控制和組裝。該過程涉及膠原蛋白等有機體系，磷酸鈣、碳酸鈣等無機體系和多類型細(xì)胞體系三方面的相互作用。理解這一復(fù)雜系統(tǒng)中生物結(jié)構(gòu)的高度選擇性控制、以及基質(zhì)和礦物的復(fù)合機制是研究生物礦化的關(guān)鍵問題。167。5. Hedgehog基因家族Hedgehog基因家族編碼一類分泌性信號分子，是1980年由Ｎ252。ssleinVolhard和Weieschaus通過突變篩選在果蠅中首先發(fā)現(xiàn)的，于1992年被克隆。hh基因在果蠅的體節(jié)和成蟲盤等的圖式形成中具有重要作用。Hh控制TGF （transforming growth factor ）,Wnt和FGF(fibroblast growth factor )信號分子的表達(dá)。隨后，在不同無脊椎動物（如海膽、水蛭和甲蟲）和脊椎動物（如斑馬魚、爪蟾、雞、小鼠和人）中均發(fā)現(xiàn)了ｈｈ同源基因，構(gòu)成一個基因家族。目前在果蠅和其它無脊椎動物中僅發(fā)現(xiàn)了一個ｈｈ基因，而在脊椎動物中則具有多個ｈｈ同源基因，包括Sonic hh (Shh)、Indian hh (Ihh)、Deserth hh (Dhh)等。其中Shh在脊椎動物神經(jīng)管、體節(jié)和肢等的發(fā)育中起著關(guān)鍵作用，Dhh和Ihh則分別參與精巢和軟骨等的發(fā)育。在小鼠、雞和斑馬魚中，Shh基因的表達(dá)均開始于原腸胚期，分別出現(xiàn)于頭突、亨氏節(jié)和胚盾處，然后逐漸擴展到整個預(yù)定脊索中胚層，隨后在神經(jīng)管腹側(cè)基板中也開始表達(dá)。在小鼠和雞中，Shh基因在脊索中的表達(dá)至少持續(xù)到體節(jié)發(fā)生結(jié)束，但在斑馬魚中Shh基因在脊索中的表達(dá)隨著它在神經(jīng)管基板中表達(dá)的開始而逐漸減弱，到22體節(jié)時Shh基因在中胚層中的表達(dá)已僅限于尾部脊索和尾芽中的少部分未分化細(xì)胞。這種差別的意義仍不清楚。有人認(rèn)為誘導(dǎo)基板產(chǎn)生是脊椎動物Shh基因最原始的功能，而其它信號功能如誘導(dǎo)運動神經(jīng)元的分化是隨后產(chǎn)生的。第三章 實驗方法167。1. 斑馬魚的獲得斑馬魚【Zebrafish (Danio rerio)】取自清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子發(fā)育實驗室，℃，按標(biāo)準(zhǔn)方法養(yǎng)殖。167。2. 透射電鏡樣品的組織固定及包埋將斑馬魚幼體直接至于容器內(nèi)，進行如下處理：1. （PH=）進行清洗。2. ％的戊二醛磷酸緩沖液固定2－3小時。3. ，每次15分鐘。4. 1％的鋨酸緩沖液固定2小時。5. ，每次15分鐘。6. 丙酮脫水： 50％丙酮 10－20分鐘70％丙酮 10－20分鐘， 4℃過夜80％丙酮 10－