培養(yǎng)細(xì)胞的冷凍保存與復(fù)蘇(編輯修改稿)
2024-10-03 23:35 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 度。復(fù)溫速率不當(dāng)也會(huì)降低凍存細(xì)胞存活率。一般來說，復(fù)溫速度越快越好。常規(guī)的做法是，在37℃水浴中，于12分鐘內(nèi)完成復(fù)蘇。復(fù)溫速度過慢，細(xì)胞內(nèi)往往重新形成較大冰晶而造成細(xì)胞損傷。復(fù)溫時(shí)造成的細(xì)胞損傷非?？?，往往在極短的時(shí)間內(nèi)發(fā)生。 168。冷凍保護(hù)劑 冷凍保護(hù)劑是指可以保護(hù)細(xì)胞免受冷凍損傷的物質(zhì)。冷凍保護(hù)劑常常配制成一定的溶液。一般來講，只有紅細(xì)胞、大多數(shù)微生物和極少數(shù)有核的哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸浮在不加冷凍保護(hù)劑的水或簡單的鹽溶液中，并以最適的冷凍速率冷凍，可以獲得活的凍存物。但對于大多數(shù)有核哺乳動(dòng)物細(xì)胞來說，在不加冷凍保護(hù)劑的情況下，無最適冷凍速率可言，也不能獲得活的冷凍物。例如將小鼠骨髓細(xì)胞懸浮在不加冷凍保護(hù)劑的平衡鹽溶液中，～600℃/min的冷凍速率降溫冷凍，98%以上的細(xì)胞會(huì)死亡；而加入甘油冷凍保護(hù)劑進(jìn)行冷凍保存時(shí)，98%以上的細(xì)胞都可存活。 冷凍保護(hù)劑可分為滲透性和非滲透性兩類。滲透性冷凍保護(hù)劑可以滲透到細(xì)胞內(nèi)，一般是一些小分子物質(zhì)，主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。其保護(hù)機(jī)制是在細(xì)胞冷凍懸液完全凝固之前，滲透到細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生一定的摩爾濃度，降低細(xì)胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，從而保護(hù)細(xì)胞免受高濃度電解質(zhì)的損傷，同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)水分也不會(huì)過分外滲，避免了細(xì)胞過分脫水皺縮。甘油和DMSO并不防止細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰，在使用該類冷凍保護(hù)劑時(shí)，需要一定的時(shí)間進(jìn)行預(yù)冷，讓甘油或DMSO等成分滲透到細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)外達(dá)到平衡以起到充分的保護(hù)作用。目前DMSO的應(yīng)用比甘油更為廣泛，但要注意的是，DMSO在常溫下對細(xì)胞的毒性作用較大，而在4℃時(shí)，其毒性作用大大減弱，且仍能以較快的速度滲透到細(xì)胞內(nèi)。所以，凍存時(shí)DMSO平衡多在4℃下進(jìn)行，一般需要40～60分鐘。非滲透性冷凍保護(hù)劑不能滲透到細(xì)胞內(nèi)，一般是些大分子物質(zhì)，主要包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羥乙基淀粉等。其保護(hù)機(jī)制的假說很多，其中有一種可能是，聚乙烯吡咯烷酮等大分子物質(zhì)可以優(yōu)先同溶液中水分子結(jié)合，降低溶液中自由水的含量，使冰點(diǎn)降低，減少冰晶的形成；同時(shí)，由于其分子量大，使溶液中電解質(zhì)濃度降低，從而減輕溶質(zhì)損傷。 不同的冷凍保護(hù)劑有不同的優(yōu)、缺點(diǎn)。目前一般多采用聯(lián)合使用兩種以上冷凍保護(hù)劑組成保護(hù)液。由于許多冷凍保護(hù)劑（如DMSO）在低溫下能保護(hù)細(xì)胞，但在常溫下卻對細(xì)胞有害，故在細(xì)胞復(fù)溫后應(yīng)及時(shí)洗滌冷凍保護(hù)劑。三、冷凍保存方法 按照冷凍保護(hù)液在凍結(jié)后是否形成冰晶來劃分，凍存方法可分為非玻璃化和玻璃化凍存兩種。非玻璃化凍存是利用各種溫級的冰箱分階段降溫至70℃～80℃，然后直接投入液氮進(jìn)行保存；或者是利用電子計(jì)算機(jī)程控降溫儀以及利用液氮的氣、液，按一定的降溫速率從室溫降至100℃以下，再直接投入液氮保存的方法。以該種方法凍結(jié)的細(xì)胞懸液或多或少都有冰晶的形成。玻璃化凍存則是指利用多種高濃度的冷凍保護(hù)劑聯(lián)合形成的玻璃化冷凍保護(hù)液保護(hù)懸浮細(xì)胞，直接投入液氮進(jìn)行凍存的方法。以該中方法凍結(jié)的細(xì)胞懸液沒有冰晶的形成。但目前細(xì)胞凍存最常用的仍是前一種方法。 （一）非玻璃化凍存方法 下面以腫瘤細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞為例，介紹非玻璃化凍存細(xì)胞的詳細(xì)過程。主要材料 （1）儀器設(shè)備：普通冰箱、30℃低溫冰箱和70℃～80℃超低溫冰箱、液氮凍存罐、高速離心機(jī)、電子計(jì)算機(jī)程控降溫儀等； （2）凍存管
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