現(xiàn)代生物科技專題9046340558(編輯修改稿)
2025-01-23 01:56 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 細(xì)菌在含青霉素 培養(yǎng)基上生長情況 細(xì)菌在含四環(huán)素 培養(yǎng)基上生長情況 ① 能生長 能生長 ② 能生長 不能生長 ③ 不能生長 能生長 A．①是 c，②是 b，③是 a； B．①是 a和 b，②是 a，③是 b； C．①是 a和 b，②是 b，③是 a； D．①是 c，②是 a，③是 b。 關(guān)于目的基因的 獲取 ? 從基因文庫中獲取目的基因 ? 利用 PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因 ? 人工合成 老師們的疑問： 這三種方法不是并列的？ PCR原料中為什么用 dNTP？（教材第 10頁） ?dNTP包括 dCTP、 dATP、dGTP和 dTTP ?同 ATP ?用單磷酸腺苷和二磷酸腺苷是不行的 關(guān)于 PCR循環(huán)參數(shù)的確定 ? 變性時(shí)間是如何確定的？ – 在選擇的變性溫度下， DNA分子越長，兩條鏈完全分開所需的時(shí)間也越長。如果變性溫度過低或時(shí)間太短，模板 DNA中往往只有富含 AT的區(qū)域被變性。 – 在 PCR的第一個(gè)循環(huán)中，有時(shí)常把變性時(shí)間設(shè)計(jì)為5 min，來增加大分子模板 DNA徹底變性的概率，又稱此為預(yù)變性。 – 當(dāng)模板 DNA的 G+C含量超過 55%時(shí)，需要更高的變性溫度，來源于古細(xì)菌的 DNA聚合酶比 Taq DNA聚合酶更能耐受高溫，因此更適合用來擴(kuò)增富含GC的 DNA模板。 ? 關(guān)于 PCR循環(huán)參數(shù)的確定 復(fù)性溫度的確定有什么考慮？ 復(fù)性過程（即退火）采用的溫度至關(guān)重要。如果復(fù)性溫度太高，寡核苷酸引物不能與模板很好地復(fù)性，擴(kuò)增效率將會(huì)非常低。如果復(fù)性溫度太低，引物將產(chǎn)生非特異性復(fù)性，從而導(dǎo)致非特異性的 DNA片段的擴(kuò)增。 ? 關(guān)于 PCR循環(huán)參數(shù)的確定 延伸的時(shí)間是如何確定的？ Taq DNA聚合酶在最適反應(yīng)溫度（ 72~78 ℃ ）下聚合速率約為 2 000 bp/min。根據(jù)多數(shù)研究者的經(jīng)驗(yàn)，確定了一個(gè)規(guī)則，即：靶基因的每 1 000 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物的延伸時(shí)間被設(shè)計(jì)為 1 min，以此類推 。 對(duì)于 PCR的最后一個(gè)循環(huán)，許多研究者常把延伸時(shí)間增加為以前循環(huán)的延伸時(shí)間的 3倍以上，以使所有擴(kuò)增產(chǎn)物完成延伸，這又稱為后延伸。 ? 關(guān)于 PCR循環(huán)參數(shù)的確定 循環(huán)數(shù)目一般都為 30，這個(gè)數(shù)值是怎么來的？ PCR擴(kuò)增所需的循環(huán)數(shù)目決定于反應(yīng)體系中起始的模板拷貝數(shù)以及引物延伸和擴(kuò)增的速率。 一旦 PCR反應(yīng)進(jìn)入幾何級(jí)數(shù)增長期，反應(yīng)會(huì)一直持續(xù)下去，直至某一成分成為限制因素。從這一點(diǎn)上來說，擴(kuò)增產(chǎn)物中絕大多數(shù)應(yīng)該是特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物，而非特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物低到難以檢測(cè)的程度。用 Taq DNA聚合酶在一個(gè)含有 105個(gè)拷貝的靶序列的反應(yīng)體系中進(jìn)行 30個(gè)循環(huán)后往往可以做到上述的理想情況。 目的基因的檢測(cè)與鑒定 —— 分子雜交技術(shù) （教材第 14頁） ? 探針標(biāo)記種類 ? 放射性同位素 、 熒光 、 生物素 （ 一種 維生素 ） ? 檢測(cè)基因工程是否成功 ? 檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的 DNA是否插入了目的基因： DNA分子雜交技術(shù) （ Southern雜交 ） ? 檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了 mRNA： Northern雜交 （ 探針是 DNA） 或 Eastern雜交 （ 探針是 RNA） ? 檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)：用免疫組織化學(xué)技術(shù)或 Western雜交 ， 原理都是抗原和抗體反應(yīng) 大腸桿菌能生產(chǎn)糖干擾素嗎？ （教材第 15頁） ? 干擾素是哺乳動(dòng)物細(xì)胞在誘導(dǎo)物的誘導(dǎo)下產(chǎn)生的一種特異糖蛋白； ? 科學(xué)家用通過基因工程用大腸桿菌生產(chǎn)出來的干擾素是沒有糖鏈的，但同樣能夠抑制病毒在細(xì)胞內(nèi)的增殖，加強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬作用和對(duì)癌細(xì)胞的殺傷作用； ? 真核細(xì)胞表達(dá)的干擾素需要糖鏈來穩(wěn)定結(jié)構(gòu)、幫助溶解，并通過轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)分泌到細(xì)胞外，進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，以發(fā)揮其抗病毒抗腫瘤的生物功效； ? 2023年 ， 科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)在一種名為 Campylobacter jejuni的細(xì)菌里存在生產(chǎn)糖蛋白的基因簇，即 pgl基因簇，此基因編碼的蛋白能夠起糖基轉(zhuǎn)移酶的作用，科學(xué)家用基因工程方法將這套基因克隆至大腸桿菌共表達(dá)，使得大腸桿菌也能夠生產(chǎn)相應(yīng)的糖蛋白。 基因診斷 ? 目前四大類疾病可以通過基因進(jìn)行診斷 ? 由單個(gè)基因突變引起的疾病 ? 常見病和多發(fā)?。ǘ嗍嵌鄠€(gè)基因引起的，如糖尿病、心臟病等） ? 癌癥（抑癌基因或癌基因異常） ? 感染性疾病（ SARS、禽流感等外源性基因） ? 現(xiàn)狀：目前已經(jīng)對(duì) 1 000中單基因病、幾十種染色體病和近百種代謝缺陷癥能用此種方法進(jìn)行明確診斷 ? 目標(biāo)：開發(fā)簡便、高效的多種疾病同步檢測(cè)技術(shù) 基因診斷常用技術(shù)（ DNA診斷技術(shù)） ? 核酸分子雜交技術(shù)，其
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