分子生物學7-核酸分子雜交(編輯修改稿)
2025-01-15 04:58 本頁面
【文章內容簡介】 聚合酶 Ⅰ Klenow片段： 5’→3’DNA 聚合酶活性 弱 3’→5’ 外切核酸酶活性 無 5’→3’ 外切核酸酶活性（ 2）隨機引物法 （random priming）單鏈探針的標記單鏈 DNA探針：利用 M13噬菌體載體合成 以 dsDNA為模板，利用噬菌體依賴于 DNA的 RNA聚合酶 于體外轉錄合成，用無 RNase的 DNA酶 Ⅰ 處理，除去模板 DNA單鏈 RNA探針：探針的末端標記 在 5’ 或 3’ 端通過酶促反應加上標記物? DNA聚合酶 ⅠKlenow 片段標記法? T4 DNA聚合酶 標記法? T4多核苷酸激酶標記法? 末端脫氧核苷酸轉移酶標記法： ddNTP為底物DNA聚合酶 ⅠKlenow 片段標記法T4DNA聚合酶 標記法T4多核苷酸激酶標記法ATP ADPγ32P非放射性標記核酸探針生物素化核苷酸1. 生物素 ( biotin ) 標記標記方法： （ 2） 光敏生物素標記法 ：強光 1020分鐘 光敏生物素的結構（ 1） 酶促標記法 ： 缺口平移法、隨機引物法、末端標記法（ T4 DNA聚合酶 標記法不能使用）2．地高辛 ( digoxigenin ) 標記法digdUTP的結構酶促標記法 ： digdNTP缺口平移法、隨機引物法、末端標記法（ T4 DNA聚合酶 標記法不能使用）核酸探針檢測方法同位素標記探針：放射自顯影檢測雜交信號 放射自顯影是指利用放射線在 x線片的成影作用來檢測雜交信號。 取出雜交膜，在 Whatman 濾紙上晾干，用保鮮膜包好，在暗室中置于 X線片上，加增感屏，固定于暗盒內， 70℃ 曝光適當時間（ 17天），在暗室中取出 X線片，顯影、定影，即可在 X線片上讀出雜交帶。非放射性標記探針：酶聯(lián)顯色Dig： 半抗原，可通過 抗原抗體反應 系統(tǒng)與 顯色體系 偶聯(lián)DigDNA探針 + 抗 Dig抗體 堿性磷酸 酶 （或辣根過氧化物酶） + 底物（ 1）偶聯(lián)反應生物素 ： 可與抗生物素蛋白（卵白素）或鏈親合素結合，再與 顯色體系 偶聯(lián)? 生物素探針 + 抗生物素蛋白 酶 + 底物? 生物素探針 + 抗生物素抗體 + 抗生物素抗體的抗體 生物素 + ABC試劑（ 2）顯色反應酶法 ：通過酶促反應使其底物形成有 顏色 的反應產物堿性磷酸酶：BCIP（ 5溴 4氯3吲哚磷酸鹽 4甲基胺藍） NBT（四氮唑藍）辣根過氧化物酶： DAB（二氨基聯(lián)苯胺） → 紅棕色TMB（四甲基聯(lián)苯胺） → 藍色第三節(jié) 核酸分子雜交技術216。 膜上印跡雜交216。 核酸原位雜交一、膜上印跡雜交 印跡技術 ： 將凝膠中待測的核酸分子轉移到一定的固相支持物上的方法。 指將待測核酸序列結合到一定的 支持物 上，然后與存在于液相中的核酸探針進行雜交的過程。1．固相支持物的選擇特點： 較強的結合核酸的能力 。 與核酸分子結合后，不影響核酸與探針的雜交反應 。 與核酸分子的結合穩(wěn)定、牢固，能經受雜交、洗膜等 操作過程而不脫落 。 非特異性吸附少，經洗膜能將非特異性吸附的探針洗脫掉 。 具有良好的機械性能 常見的固相支持物：硝酸纖維素膜（ nitrocellulose filter membrane）：尼龍膜（ nylon membrane）：化學活化膜：聚氟偏乙烯膜（ PVDF膜）2．印跡方法
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