石蠟切片制備基本步驟(編輯修改稿)
2024-09-01 09:32 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 平鋪于硬紙片上或吸水紙上分段固定。 （8）取材要盡量注意臟器的完整性。 （9）應根據(jù)所要觀察的部位及實驗目的進行選擇組織的切面。對于病理材料，除切取病變部位外，還要切取病變和正常組織交界部分的區(qū)域，以利于進行正常組織與病理組織的對比觀察分析。 （10）取材時要注明取材時間、組織器官名稱、固定液名稱、組織塊的數(shù)量、所取組織位于器官的部位等，以備查。 （六） 固定1．固定的目的（1）防止組織溶解及腐敗，以保持組織和細胞與正常生活時的形態(tài)相似；（2）使細胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂肪、糖、酶等各種成分轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄晕镔|(zhì)，以保持它原有的結(jié)構(gòu)與生活時的相仿；（3）組織細胞內(nèi)的不同物質(zhì)經(jīng)固定后可以產(chǎn)生不同的折光率，對染料也產(chǎn)生不同的親和力，造成光學上的差異，使得在生活情況下原來看不清楚的結(jié)構(gòu)變得清晰起來，并使得細胞各部分容易著色，有利于區(qū)別不同的組織成分。（4）固定劑的硬化作用，增加組織硬度，便于制片。2．固定的對象和方法（1）固定的主要對象是蛋白質(zhì)；（2）固定液的量要足夠，其固定液的量一般不少于組織總體積的10倍以上（一般為1：20）。對于某些需要制作神經(jīng)染色和酶組織化學染色的組織固定，比一般的固定要嚴格。（3）特殊的固定方法（注射或灌注固定）：某些組織塊由于體積過大或固定液極難滲入內(nèi)部或需要對整個臟器或整個動物進行固定，宜采用此方法，將固定液注入血管，經(jīng)血管分支到整個組織和全身，從而得到充分固定。①局部灌注固定：肺：肺內(nèi)含有空氣，固定難以滲入，可將固定液從氣管、支氣管或肺動脈注入固定液，從支氣管注入時速度一定要慢，量不宜過多。注射固定后可將整個肺投入固定液中6~12小時，再分別切成小塊。肝、腎：經(jīng)肝動脈或腎動脈注入固定液。腦：動物麻醉后暴露頸動脈，以注射針尖向著關(guān)部的方向注入固定液。②全身灌注固定：步驟：取大白鼠，1%戊巴比妥鈉麻醉，打開胸、腹腔，縱向切開心包，用紗線在主動脈弓起始部，然后用50ml注射器，選用適當針頭，從左心室向主動脈方向刺入，將紗線扎緊固定，在右心房開一孔放血，取用與動物等量的生理鹽水注入血管中洗滌，待洗滌處的液體不見血時，再注入固定液。待動物體有一定硬度時即可取材，將所需組織從動物身上切去后，經(jīng)適當處理，即投入固定液中（甲醛或多聚甲醛）3．固定液的性質(zhì)和條件（1）能迅速滲入組織，使組織細胞形態(tài)在短期內(nèi)不至于有較大變化。（2）固定液有相當?shù)臐B透力，對組織各部分的滲透力相等，可使組織內(nèi)外完全固定。（3）使組織細胞不至于因固定而引起人為的改變。（4）盡可能避免固定劑使組織膨脹或收縮。（5）使組織達到一定硬度，獲得較佳的折光率和對染料具有較強的親合力。4．固定時應注意的事項（1）固定液及被固定的組織必須新鮮；（2）固定液的用量一般為組織體積的10~20倍，容器不要過小，材料也不要太多；應避免組織緊貼瓶底或瓶壁，以免影響固定液的滲入，必要的時候可以在瓶底墊上一層棉花；（3）固定時間視組織塊的種類、性質(zhì)、大小，固定液的種類、性質(zhì)、滲透力的強弱，固定時的溫度的高低，實驗目的等；（4）防止被固定的組織因固定劑的作用而發(fā)生變形；（5）固定所用的固定液，以新配的為好，放置過久會失效；（6）在固定期間搖動組織或搖動容器有利于固定液的滲入，對長期固定的標本，可經(jīng)常更換固定液（7）取材固定應同時作好記錄，包括組織名稱、固定液和時間等內(nèi)容。5．固定劑單純固定劑（1）10%甲醛：對組織滲透性強，固定均勻。對組織膨脹約5%，經(jīng)酒精脫水時有較大的收縮。能保存脂肪，不能沉淀核蛋白及白蛋白，長期用其固定的組織使組織變?yōu)樗嵝?，不利于染色，特別是細胞核的著色。經(jīng)自來水沖洗6~24小時后，可以使其酸堿中和，并減少結(jié)晶。（2）4%多聚甲醛：對組織穿透性好，組織收縮小，對大多數(shù)抗原物質(zhì)保存較好，特別是對脂肪和各種酶的固定效果更好。固定的時間不宜太長，以24小時以內(nèi)為宜，適用于免疫組織化學染色。（3）飽和的苦味酸溶液：能沉淀一切蛋白質(zhì)，滲透力弱，對組織收縮大，故一般不能單獨使用。（4）冰醋酸：滲透力強，沉淀核蛋白，對染色質(zhì)固定好，使組織膨脹，故一般不單獨使用。（5）鋨酸：價格昂貴，為強氧化劑，易還原成氫氧化鋨，呈黑色沉淀；必須避光保存。不能沉淀蛋白質(zhì)，而使蛋白質(zhì)凝膠化，所以對蛋白質(zhì)固定不均勻，鋨酸固定的細胞能保持生活時的形態(tài)，不收縮細胞，對胞質(zhì)固定較長好，核的固定不好，鋨酸為脂肪及類脂質(zhì)的優(yōu)良固定劑，經(jīng)它固定的脂肪和類脂質(zhì)呈黑色，特別是對于是顯示線粒體和高難度爾基復合體效果良好?；旌瞎潭▌?）Bouin氏固定液：為常用的良好的固定劑，穿透速度快，組織收縮性較小，固定均勻，固定后組織有適當?shù)挠捕?，對于切片和染色均有良好的效果。一般固?2~24小時，固定后入70%酒精洗去苦味酸的黃色，在脫水時經(jīng)各濃度酒精也可洗去黃色，在酒精中加入氨水一滴或少許碳酸鉀飽和水溶液，可加快洗去苦味酸的黃色即使留有少量苦味酸的黃色，對一般染色體并無影響。（2）Zenker液（）：此液多用于一般組織的固定，它能使細胞核、細胞質(zhì)染色清晰但固定時間長，一般要12~36小時，加熱可以縮短固定時間。固定后的組織必須流水沖洗12小時，由于固定中含有升汞，在經(jīng)70%酒精脫水時，加少量的碘液（%碘酒精）以脫汞。（3）Carnoy液：滲透力強，特別適宜于固定染色體、肝糖、粘液等一些較為細微的結(jié)構(gòu)。顯示DNA、RNA效果良好。（4）改良Bouin氏固定液：此液對一般組織固定效果都很好，固定時間為4~18小時，固定后直接放70%乙醇脫水，固定時間較長對組織亦無損害。（七） 組織塊修整 固定后的組織塊可能會在外部形態(tài)上有些改變，或者由于組織在還未固定時就取材，組織器官較軟，取材不容易切平。經(jīng)固定后的組織有一定的硬度，此時就可以做一些修整，但改變不要太大，只是將組織材料切取平整，修掉一些不規(guī)則的部位。修整組織塊時，手術(shù)切片一定要鋒利。 石蠟切片制備基本步驟 之三 四、水洗1．目的： 洗去滲入組織中的固定液，終止固定。以免影響對組織內(nèi)結(jié)構(gòu)的觀察、分析和研究。 2．原則和方法： 固定后的組織塊的沖洗，一般情況下是置水龍頭下以自來水流水沖洗，這樣可以使組織中的固定液隨時溢出，洗得更干
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