【文章內(nèi)容簡介】 glycol，ＰＥＧ）法是從促進(jìn)原生質(zhì)體融合的方法中衍生出來的，于1980年由Dave等首先建立． Pazkowski等(1984)報(bào)道了第一側(cè)用PEG法轉(zhuǎn)基因成功的植物． 后來隨著單子葉植物原生質(zhì)體分離培養(yǎng)的植株再生技術(shù)的發(fā)展,PEG法轉(zhuǎn)化植物成功的報(bào)道已越采越多。其方法本身也隨之得到很大的改進(jìn)，轉(zhuǎn)化率已達(dá)到了現(xiàn)在的102甚至更高，已成為了一種常用且比較成熟的植物原生質(zhì)轉(zhuǎn)化方法基本原理 PEG是一種選擇性化學(xué)滲透劑，分子質(zhì)量可從1500～12000，~，因多聚程度不同而異。 它可以使細(xì)胞膜之間或使DNA與細(xì)胞膜形成分子橋，促使相互間的接觸和粘連，并可通過改變細(xì)胞膜表面的電荷，引起細(xì)胞膜透性變化，從而促進(jìn)外源大分子進(jìn)入原生質(zhì)體，因此稱之為PEG誘導(dǎo)法。 PEG誘導(dǎo)所引起的細(xì)胞膜透性改變是可以恢復(fù)的。 在PEG轉(zhuǎn)化過程中常需加入Ca2+離子，這種二價陽離子可與DNA結(jié)合成DNA磷酸鈣復(fù)合物而使DNA沉積于原生質(zhì)體的膜表面，并促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生內(nèi)吞作用． 此外，高pH值可誘導(dǎo)原生質(zhì)體的融合和外源DNA分子的攝取，因此，但高于10時則會損傷原生質(zhì)體。PEG法正是利用以上因素作用于植物原生質(zhì)體，使加在培養(yǎng)液中的外源DNA分子進(jìn)入細(xì)胞而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化目的的。第四節(jié) 浸漬法 浸漬法：是指將植物的種子，胚、胚珠，子房、花粉粒、幼穗，懸浮細(xì)胞甚至幼苗等直接浸泡在外源DNA溶液中，利用滲透作用把外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞并得到整合與表達(dá)的一種轉(zhuǎn)化方法。這種方法實(shí)際上在經(jīng)典的基因工程誕生之前就有人開始探索了，這一想法的萌芽是受細(xì)菌轉(zhuǎn)化現(xiàn)象的啟發(fā)，早在1969年，德國學(xué)者Hess便報(bào)道了用外源DNA浸泡矮牽牛的萌動種子而出現(xiàn)變異性狀的結(jié)果。一、基本原理 浸漬法主要是利用植物細(xì)胞自身的物質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)系統(tǒng)將外源DNA分子直接導(dǎo)入受體細(xì)胞?，F(xiàn)已證明植物細(xì)胞至少可以通過以下幾種途徑將外源DNA吸入細(xì)胞內(nèi)： ①外源DNA可以通過細(xì)胞間隙與胞間連絲組成的網(wǎng)絡(luò)化的運(yùn)輸系統(tǒng)而被運(yùn)輸?shù)矫恳粋€細(xì)胞內(nèi)； ②植物細(xì)胞也可以通過類似動物細(xì)胞的內(nèi)吞作用將外源DNA攝入細(xì)胞內(nèi)；③植物組織中細(xì)胞的膜透性改變也可以為大分子物質(zhì)透過細(xì)胞膜提供機(jī)會，尤其是在生殖細(xì)胞、胚胎細(xì)胞以及分生細(xì)胞中，外源DNA進(jìn)入細(xì)胞中的機(jī)會更大。二、基本方法 浸漬法，就是將不同的受體系統(tǒng)直接放入供體DNA(包括總DNA和質(zhì)粒DNA)溶液中浸泡一段時間，再經(jīng)過自然發(fā)育或人工培養(yǎng)面得到轉(zhuǎn)化植株。以種子為受體的基本操作方法：％的升汞或20％～30％次氯酸鈉消毒，無菌剝?nèi)シN皮(也可剝出幼胚)；SSC緩沖液中，加入20％的二甲基亞砜(DMSO)；(100—200μg／m1)，浸泡30min至數(shù)h； SSC緩沖液沖洗干凈；，轉(zhuǎn)入無激素的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)；(用質(zhì)粒DNA浸泡的種子)，或成苗后轉(zhuǎn)載到土壤中進(jìn)行變異性狀分析(用總DNA浸泡的種子)。三、基本特點(diǎn) 浸漬法是高等植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)中最簡單，快速，便宜的一種轉(zhuǎn)化方法．它不需要昂貴的儀器設(shè)備和復(fù)雜的組織培養(yǎng)技術(shù)，可以進(jìn)行大批量的受體轉(zhuǎn)化工作，并且此法容易推廣普及。 但該法的轉(zhuǎn)化頻率較低，重復(fù)性較差，篩選和檢測也困難，往往很難得到分子生物學(xué)證據(jù)。第五節(jié) 花粉管通道法花粉管通道法：是利用植物受精過程中形成的花粉管通道將外源DNA導(dǎo)入植物的技術(shù)。 是由我國學(xué)者周光宇提出并建立的一種非常實(shí)用的轉(zhuǎn)基因技術(shù)． 這一方法也在實(shí)際應(yīng)用中得到了不斷的發(fā)展和完善，成為分子育種最有價值的方法之一。 一、基本原理授粉后外源DNA能沿著花粉管滲入，經(jīng)過珠心通道進(jìn)入胚囊，轉(zhuǎn)化尚不具備正常細(xì)胞壁的卵、合子或早期胚胎細(xì)胞。周光宇等認(rèn)為在受精及胚胎發(fā)育的初期是植物接受遠(yuǎn)緣遺傳物質(zhì)的敏感時期。因?yàn)椋海?）精、卵細(xì)胞類似天然的原生質(zhì)體；（2）在精子入卵時，卵膜有一個開閉的過程；（3）合子期，胞壁的形成也尚未完備，胞壁的屏障作用還很小，因此外源基因進(jìn)入受體卵細(xì)胞及合子的阻力也較小：（4）雄配子體花粉萌發(fā)時，頂部也擁有無壁的小孔，外源遺傳物質(zhì)也容易吸入．二、操作方法利用花粉管道道導(dǎo)入外源DNA的技術(shù)已發(fā)展出多種行之有效的操作方法，基本歸納為三類：：當(dāng)受體植物自花授粉一定時間后(一般2~3h）切去花柱； 然后馬上在切口上滴入供體DNA溶液，濃度為50~100ug/ml，溶于1XSSC(150m molNaCl，15m mol檸檬酸鈉，）；最后套袋隔離至種子成熟。： 收集新鮮花粉加入到供體DNA溶液(、20mmol硼酸鈉，DNA終濃度40ug／ml)中，混勻，使外源DNA被吸入花粉粒；然后取混合液滴于預(yù)先去雄套袋隔離的雌蕊上進(jìn)行人工授粉；再繼續(xù)套袋至種予成熟。3．柱頭涂抹法： 在未授粉前先用DNA溶液涂抹柱頭，然后人工授粉套袋隔離，通過花粉管的伸入將外源DNA帶入胚囊，成熟后收獲種子． 上述各種方法的操作程序中，都要設(shè)置以不含DNA的等量SSC溶液作相同處理為對照．所有獲得的處理與對照的種子均需點(diǎn)播在同一試驗(yàn)田進(jìn)行田間鑒定和篩選．三、基本特點(diǎn) 花粉管通道法是利用自然繁殖過程中整體植株的卵細(xì)胞、受精卵或早期胚細(xì)胞作為轉(zhuǎn)化受體，無需細(xì)胞，原生質(zhì)體等組織培養(yǎng)和誘導(dǎo)再生植株等一整套人工培養(yǎng)過程。 這樣，就避免了原生質(zhì)體再生以及組織培養(yǎng)過程中可能導(dǎo)致染色體變異或優(yōu)良農(nóng)藝性狀喪失的問題。 且此方法不受植物種屬的限制，在具備有性生殖過程的任何植物上都能應(yīng)用． 另外，此法簡便，易于掌握，可以在大田，盆栽或溫室中進(jìn)行，育種時間短，篩選遺傳穩(wěn)定的品系一般只需3—4代時間， 再者，通過外源總DNA片段的導(dǎo)入可以了解一些具有重大經(jīng)濟(jì)價值的農(nóng)藝性狀是否能夠通過DNA片段進(jìn)行轉(zhuǎn)移、這些性狀是單基因性狀還是多基因性狀，從而能為目的基因的克隆提供參考和材料。 但此法的使用在時間上受到開花季節(jié)的限制，而且應(yīng)用總DNA片段的導(dǎo)入，篩選到的子代可能帶有目的基因以外的DNA片段． 總之，目前花粉管導(dǎo)入法已有了一定的理論基礎(chǔ)和大量的實(shí)踐證實(shí)，它的簡捷特性以及可以直接得到轉(zhuǎn)化種子等優(yōu)點(diǎn)使之成為目前廣泛使用的轉(zhuǎn)化方法之一．第六節(jié) 顯微注射法顯微注射： 是利用顯微裝置將大分子物質(zhì)或細(xì)胞器注射到培養(yǎng)細(xì)胞的一項(xiàng)技術(shù)。 該技術(shù)歷史悠久，最初主要用于兩犧類動物的核移植以及哺乳類和魚類卵細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化。 近年來，植物懸浮細(xì)胞、花粉粒以及多細(xì)胞結(jié)構(gòu)的分生組織、胚狀體等都被用作顯徽注射的受體材料，并使該方法在理論上和技術(shù)上都有了進(jìn)一步的發(fā)展 。一、基本原理 其基本原理是利用顯微注射儀將外源DNA直接注入受體細(xì)胞，并使其成活、增殖而發(fā)育成為轉(zhuǎn)基因個體。 顯微注射中的一個重要環(huán)節(jié)是固定受體細(xì)胞，目前采用的固定方法有三種：① 脂糖包埋法。②多聚L賴氨酸粘連法。③吸管支持法。二、操作步驟 三、基本特點(diǎn) 顯微注射法的突出優(yōu)點(diǎn)是轉(zhuǎn)化率高，有研究表明，它的瞬時表達(dá)頻率可達(dá)30％或更高，這是其他方法所不及的． 另外，它是一種純粹的物理方法，能適用于各種植物和各種材料。 最近有人利用改良后的這一方法對植物的子房，穗頸等進(jìn)行直接注射，也獲得了理想的結(jié)果。 再者，此法的整個操作過程對受體細(xì)胞無藥物毒害，有利于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長發(fā)育。其缺點(diǎn)是操作繁瑣耗時，工作效率低，并需要精細(xì)的操作技術(shù)和精密的儀器設(shè)備，難以進(jìn)行大批量的轉(zhuǎn)化工作．第七節(jié) 電激法電激法也稱電穿孔法：是利用高壓電脈沖作用使細(xì)胞膜上形成可逆性的瞬間通道，從而使外源DNA分子進(jìn)入細(xì)胞的轉(zhuǎn)化方法。此法是80年代初發(fā)展起來的，最初主要用于原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化。一、基本原理 細(xì)胞膜主要由脂類組成，每一個脂質(zhì)分子都有極性的頭部和疏水的尾部，因此細(xì)胞膜可以視為一種電容，其靜息膜電位(Vm)約為100mV。 當(dāng)細(xì)胞處于一個外加電場中時，膜電位增高，即VVm。V的高低與電場強(qiáng)度(E)成正比。隨著E的不斷增大，V也不斷升高，于是膜被壓縮變薄。 當(dāng)V升高到一定值時，膜被擊穿形成微孔，此壓稱之為擊穿電壓(Vc)． 如果電場強(qiáng)度不再繼續(xù)增大，此時所形成的膜孔數(shù)量少、孔徑小，間隔一段時間后即可復(fù)原，這稱之為“可逆擊穿”。 對受體細(xì)胞施以可逆擊穿電場強(qiáng)度即可達(dá)到電擊穿孔轉(zhuǎn)化的目的．二、基本特點(diǎn) 電激法在轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體上取得了良好的效果，已被國際上公認(rèn)為是一種成熟可靠的轉(zhuǎn)化方法。 它除了同樣具有PEG法的優(yōu)點(diǎn)外，還具有操作簡便、轉(zhuǎn)化效率較高的特點(diǎn)，特別適用于瞬時表達(dá)的研究。 另外，這種方法無宿主的限制，對胚性愈傷組織、懸浮細(xì)胞，分生組織均可采用。并有研究表明，此法與PEG法結(jié)合使用，可大大提高轉(zhuǎn)化頻率。 其缺點(diǎn)是易造成細(xì)胞膜的損傷，使植板率降低，而且儀器也較昂貴，各項(xiàng)轉(zhuǎn)化參數(shù)還有待進(jìn)一步的優(yōu)化。第八節(jié) 超聲波導(dǎo)入法超聲波導(dǎo)入法：利用低聲強(qiáng)脈沖超聲波的物理作用將外源DNA分子導(dǎo)入細(xì)胞的一種轉(zhuǎn)化方法， 我國學(xué)者最早建立并應(yīng)用該技術(shù)將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞。一、基本原理超聲波是指頻率為210 4～2109Hz的聲波，它的生物學(xué)效應(yīng)主要是機(jī)械作用，熱化作用和空化作用。熱化作用：生物組織在超聲機(jī)械能的作用下由于粘滯吸收，將一部分超聲被轉(zhuǎn)化為熱能，使生物組織的慍度上升，稱之為超聲波的熱化作用。機(jī)械力作用：由于生物組織大多數(shù)屬軟組織，因而在超聲波的機(jī)械力作用下，其細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)生變形，當(dāng)超聲波的強(qiáng)度增加到一定程度時，細(xì)胞膜就會擊穿。空化作用：組織在緩沖液中經(jīng)超聲波處理后，在緩沖液下會形成大量的小氣泡．這些小氣泡在湮滅過程中產(chǎn)生高溫及高壓，甚至產(chǎn)生電離效應(yīng)，而導(dǎo)致細(xì)胞壁與質(zhì)膜的擊穿或可逆的通透性的變化。 這些因素將使得外源DNA進(jìn)入到細(xì)胞中。二、基本特點(diǎn) 超聲波轉(zhuǎn)化方法不受受體種類的限制，不僅適用于原生質(zhì)體，而且適用于帶壁細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，并且操作簡單、轉(zhuǎn)化效率高，不失為一種很有應(yīng)用潛力的轉(zhuǎn)化方法．但該轉(zhuǎn)化方法外源DNA用量較大，另外還有許多參數(shù)有待于優(yōu)化。第九節(jié) 激光微束法 激光微束法：利用激光微束使細(xì)胞壁和細(xì)胞膜穿孔，從而將DNA導(dǎo)入細(xì)胞的方法。1984年Tsukakoshi等這種方法對動物細(xì)胞進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。一、基本原理激光是一種很強(qiáng)的相干單色電磁射線，細(xì)胞膜系統(tǒng)或細(xì)胞內(nèi)的某些結(jié)構(gòu)由于能夠吸收特定波長的激光產(chǎn)生熱效應(yīng)而引起某種程度的損傷?！?。這種直徑很小，但能量很高的激光束可使細(xì)胞膜產(chǎn)生可逆性穿孔，利用激光微束的這種穿刺效應(yīng)可以使外源DNA導(dǎo)入到受體細(xì)胞中。二、基本特點(diǎn) 激光徽束轉(zhuǎn)化技術(shù)同基因槍、電擊穿孔和超聲波法一樣，屬于物理轉(zhuǎn)化方法。 其優(yōu)點(diǎn)是無宿主限制，可適用于各種功能植物材料和各種類型的受體細(xì)胞，并且操作簡單、方便，轉(zhuǎn)化效率較高，每分鐘可操作100個左右的細(xì)胞，比顯微注射法效率提高20倍，比化學(xué)法提高三個數(shù)量級； 另外，還可進(jìn)行細(xì)胞器的基因轉(zhuǎn)化，由于激光微束小于細(xì)胞器，它可以在顯微水平上直接對細(xì)胞器擊孔，實(shí)現(xiàn)外源DNA對細(xì)胞器的轉(zhuǎn)移． 但其需要昂貴的儀器設(shè)備，轉(zhuǎn)化頻率只有102～104。其穩(wěn)定性和安全性目前還不如電激法和基因槍法．第十節(jié) 碳化硅纖維介導(dǎo)法碳化硅纖維介導(dǎo)法是由美國明尼蘇達(dá)州立大學(xué)Kaeppler等(1990)首先建立起來的。 一、基本原理 碳化硅是一種單晶硅，長度為直0～80um。這種纖維具有很高延展強(qiáng)度，其物理特性類似于石棉，表面光滑、不易結(jié)塊。 將它加入到含有受體細(xì)胞和外源DNA的轉(zhuǎn)化液中混合振蕩，在相互碰撞中，纖維絲可對細(xì)胞產(chǎn)生穿刺作用，那些粘附于纖維絲上或細(xì)胞壁上的DNA將隨之進(jìn)入細(xì)胞，而完成轉(zhuǎn)化作用． 值得注意的是，碳化硅纖維吸入肺部容易引起傷害，因此應(yīng)在通風(fēng)柜中進(jìn)行操作，一般先配成5%的懸液備用，以減少它往空氣中的飄逸。二、基本特點(diǎn) 碳化硅穿刺技術(shù)具有簡便、快速，成本低的特點(diǎn)，而且單子葉及雙子葉植物均可采用，不需要昂貴的設(shè)備，可以轉(zhuǎn)化完整細(xì)胞和組織。 但這種方法尚不夠成熟，轉(zhuǎn)化組織快時，多只對表層細(xì)胞有效，尚有許多參數(shù)有待進(jìn)一步優(yōu)化。 另外，穿入細(xì)胞的纖維絲會不會影響細(xì)胞的生長及分化，仍是一個值得研究的問題．第十一節(jié) 其他轉(zhuǎn)化方法一、脂質(zhì)體介導(dǎo)法 脂質(zhì)體介導(dǎo)法是用脂類化學(xué)物質(zhì)合成人工脂質(zhì)膜，把外源DNA分子包裹在膜內(nèi)形成脂質(zhì)體，然后通過植物原生質(zhì)體的吞噬或融合作用把內(nèi)含的DNA轉(zhuǎn)入到受體細(xì)胞中，因此它屬于一種化學(xué)轉(zhuǎn)化方法。二、病毒介導(dǎo)法 病毒侵染植物后，其核酸分子可以進(jìn)入植物細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制和蛋白質(zhì)合成。 將植物病毒用作植物基因表達(dá)載體。去掉病毒基因組中對病毒繁殖非必需的一段核苷酸序列，換上一小段外源DNA，而不至于影響病毒基因組正常的包裝。用病毒載體介導(dǎo)植物基因轉(zhuǎn)移，可以用病毒直接接種或通過農(nóng)桿菌接種二種方式把帶有外源DNA的重組病毒基因組導(dǎo)入植物細(xì)胞。 三、電泳轉(zhuǎn)化法 電泳轉(zhuǎn)化法的基本原理是借在一定電場強(qiáng)度下由負(fù)極向正極泳動的DNA泳動力，將DNA引入到靠正極端的受體組織細(xì)胞中． 細(xì)胞壁是以纖維絲為基質(zhì)而組成的，含有許多小孔，在電場中DNA遷移可通過細(xì)胞壁的小孔，并可通過質(zhì)膜而進(jìn)入細(xì)胞． 四、轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)法 轉(zhuǎn)座子：是指在細(xì)胞中能從同一條染色體的一個位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到另一個位點(diǎn)或從一條染色體上轉(zhuǎn)移到另一條染色體上的一段特殊的DNA序列； 它通常包含著二種因子：一是自主因子，具有使自身剪切或轉(zhuǎn)座的能力；另一是非自主因子，只有在同一組自主因子存在時才能剪切或轉(zhuǎn)座。 將植物這種內(nèi)源轉(zhuǎn)座子從系統(tǒng)分離出來，構(gòu)建在含有目的基因的表達(dá)載體上，并通過適當(dāng)方法將之導(dǎo)入到受體細(xì)胞中，利用轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座功能，可將其鄰近的目的基因轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞的染色體上，即可實(shí)現(xiàn)外源基因的有效整合與表達(dá) 。目前，由于轉(zhuǎn)座于在異源植物中轉(zhuǎn)座活性的研究剛剛開始，涉及的物種范圍還很窄。再者，通過轉(zhuǎn)座子所導(dǎo)入的外源基因的遺傳穩(wěn)定性還有待進(jìn)一步研究。所以，轉(zhuǎn)座子作為一種新的轉(zhuǎn)移外源基因的載體系統(tǒng)和方法，還需要有更多的實(shí)